Karıştırılmış tank biyoreaktör kabından, biyoreaktör kontrolöründeki sıcaklık pH'ını ve çözünmüş oksijen kontrolünü geçici olarak durdurun ve kaptan tüm PBS'yi atık şişesine tamamen dağıtın. Tek kullanımlık filtrasyon modülüne 10 litrelik tek kullanımlık saklama torbasındaki bir bağlantı noktasına kaynak yapın. Serum içermeyen MSC besiyerini filtreleyin ve saklama torbasına aktarın.
Pompayı bir hız 300 RPM'ye ayarlayın. Ve besleme torbasından bir litre ortamı kaba dağıtın. Pompayı durdurun.
Ve sıcaklığı başlatın pH ve üreticinin talimatlarına göre tekrar DO'ya çözün. Geri beslemeyi besleme borusuna bağlayan boruyu kapatın ve ayırın. Boruyu dağılmış mikro taşıyıcıların şişesinden besleme borusuna kaynaklayın.
Ve şişedeki tüm içeriği kaba pompalayın. Daha sonra, serum içermeyen bir ortamda sekiz HMC'ye 2.5 kez 10 kez yeniden süspanse edin ve bunları daha önce mikro taşıyıcı süspansiyonu içeren boş şişeye aktarın. Şişenin içine toplamda 500 mililitreye kadar serumsuz ortam ekleyin ve hücre süspansiyonunu karıştırın.
Şişedeki tüm içeriği kaba pompalayın. Şişeyi besleme borusuna bağlayan boruyu kapatın ve ayırın ve ardından besleme torbasını geri kaynaklayın. Mikro taşıyıcılara hücre aşılamasını başlatmak için kontrolördeki çalkalama ayarlarını yapın.
Ve otomatik bir orta takviye ve değişim rejimi oluşturun. Tek kullanımlık numune alma torbalarını numune alma tüpüne kaynaklayın. Ve istenen zaman noktalarında numune toplayın.
Kontrolörde hücre hasadı sırasında, mikro taşıyıcıların yerleşmesi için çalkalama hızını sıfıra ayarlayın. Ve süpernatanı besleme rejimine dağıtın ve kapta yaklaşık bir litre kültür süspansiyonu bırakın. 50 mililitre taze hazırlanmış sindirim çözeltisi içeren torbayı seyreltme için 500 mililitre HBSS'ye kaynaklayın.
Ve tüm çözeltiyi besleme borusu aracılığıyla kaba pompalayın. Mikro taşıyıcıları çözmek için çalkalama hızını 40 ila 45 RPM arasında ayarlayın. Mikro taşıyıcılar 40 ila 60 dakika içinde çözüldükten sonra, tek kullanımlık üç litrelik saklama torbasını hasat tüpüne kaynaklayın ve hücre süspansiyonunu tamamen dışarı pompalayın.
Hücre hasadı sırasında hücre işleme sistemini açın. Ve üreticinin talimatlarına göre cihaza tek kullanımlık bir hücre işleme kiti takın. Hücre süspansiyonu, yıkama tamponu ve kültür ortamı torbalarını kite kaynaklayın.
Çalışma parametrelerini girin ve otomatik yıkama ve yeniden askıya alma işlemini başlatın. Hücre yoğunluğu hesaplaması için hücre işleme sistemleri tarafından belirtildiği gibi santrifüj odasından hücre örneğini toplayın. Saydıktan sonra, tam serum içermeyen ortamı kullanarak hücre yoğunluğunu mililitre başına altı hücreye iki kez 10 olarak yeniden ayarlayın.
15 litrelik bir biyoreaktörde hücre formülasyon işlemi için, hasat edilen hücreleri yeniden süspanse etmek için formülasyon tamponu kullanın. Hücre dolgusuna 250 mililitre yeniden askıya alınmış hücre kaynaklayın. Tek kullanımlık doldurma ve bitirme sarf malzemesini hücre doldurma sistemine monte edin.
Ve hücreler yeniden askıya alınmadan önce üreticinin talimatlarını izleyerek ön soğutma sistemini açın. Sistemdeki talimatları izleyin ve set başına toplam 20 torba olmak üzere torba başına 30 mililitre dolduracak şekilde ayarlayın. Yeni 20 kriyo koruma torbası setini tek kullanımlık doldurma ve bitirme sarf malzemesi kitine kaynaklayın ve tüm hücreler ayrılana kadar doldurma ve bitirme işlemini tekrarlayın.
HMSC'ler için, %90'ın üzerinde hücre canlılığı ile kümülatif 128 kat genişleme sağlandı Glikoz alımı, sağlıklı hücre büyümesi ile ilişkili metabolizmayı gösteren hücre genişlemesi ile negatif bir korelasyon sergiledi. Taze hasat edilmiş MSC'ler, pozitif belirteçler için %95'ten fazla ve negatif belirteçler için %2'den az ekspresyon ile klasik fenotipik belirteçleri korur. Kriyo ile korunmuş hücreler, çözülme ve 2D şişelere yeniden kaplandıktan sonra spiral büyüme ile iyi yapışma, normal genişleme davranışı ve tipik iğ şekli gösterdi.
Ayrıca, hücreler osteojenik, adipojenik ve kondrojenik soylara farklılaşma yeteneklerini de korudular. Bu platform, HEK293T ve Vero hücreleri gibi diğer ankraj bağımlı hücreleri de yetiştirmek için kullanılabilir. 15 litrelik biyoreaktördeki B2B transfer işleminden sonra, HEK293T hücreleri, mililitre başına yedi hücrenin 10'unun 1.68 katı kadar bir tepe hücre konsantrasyonuna ulaştı.
Vero hücreleri, yedi hücreye 10 kez 1.08 kez bir konsantrasyona ulaşırken. Her iki hücre tipi de yüksek canlılığı korudu.
