Alkalin fosfataz testi ve kalsiyum biriktirme deneyleri için, uygun ortamda kültürlenmiş hücre tohumlu, elma türevi iskeleleri PBS ile üç kez yıkayarak başlayın. İskeleleri 30 dakika boyunca% 10 nötr tamponlu formalin ile sabitleyin. Alkalin fosfataz testi için, bir BCIP / NBT tabletini 10 mililitre deiyonize su içinde çözerek BCIP / NBT boyama çözeltisi hazırlayın.
Daha sonra sabit iskeleleri %0,05 TWEEN solüsyonu ile yıkayın ve oda sıcaklığında 20 dakika BCIP/NBT solüsyonu ile boyayın. Leke iskelelerini %0,05 TWEEN solüsyonu ile yıkayın ve PBS'de saklayın. Ardından, 12 megapiksel dijital kamerayla lekeli iskeleleri görüntüleyin.
Kalsiyum biriktirme testi için, ağırlıkça %2 Alizarin Red S boyama solüsyonu hazırlayın. Daha sonra sabit iskeleleri deiyonize su ile yıkayın ve oda sıcaklığında bir saat boyunca Alizarin Red S solüsyonu ile boyayın. Lekeli iskeleleri deiyonize su ile yıkayın ve görüntülemeden önce PBS'de saklayın.
12 megapiksel dijital kamera ile görüntü. Young modül ölçümlerini gerçekleştirmek için, hücre tohumlu iskeleleri ilgili inkübasyon ortamlarından çıkarın ve numuneleri 1.5 Newton yük hücresi ile donatılmış özel yapım tek eksenli bir sıkıştırma aparatı kullanarak hemen test edin. İskeleleri, iskele yüksekliğinin maksimum %10'u kadar bir basınç gerilimine kadar dakikada üç milimetre sabit bir hızda sıkıştırın.
Gerilim/gerinim eğrilerinin doğrusal kısmının eğiminden Young modülünü belirleyin. BCIP/NBT boyama, farklılaşma ortamında kültürlenen hücre tohumlu iskelelerde, boş veya farklılaşma olmayan orta kültür hücre tohumlu iskelelere kıyasla alkalin fosfataz aktivitesinde önemli bir artış olduğunu ortaya koydu. Alizarin Red S boyaması için de benzer sonuçlar elde edildi, bu da farklılaşma ortamında kültürlenen hücre tohumlu iskelelerde daha fazla kalsiyum mineralizasyonuna işaret etti.
Farklılaşma ortamında kültürlenen hücre tohumlu iskelelerin Young modülü 192.0 kilopaskal civarındaydı, bu da boş veya farklılaşma olmayan orta kültür hücre tohumlu iskelelerden önemli ölçüde daha yüksekti ve bu da daha yüksek sertliğe işaret ediyordu.
