Başlamak için, çip ve talaş taşıyıcıyı steril bir doku kültürü kabında bulunan çip kızağına yerleştirin ve çip aktivasyon reaktifini hazırlarken doku kültürü başlığında bir kenarda tutun. CR1 tozu içeren şişeye bir mililitre CR2 çözeltisi ekleyin. Çözeltiyi flakondan alüminyum folyoya sarılmış 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.
CR1 şişesinden dört durulama ve dört mililitre CR2 yıkanana kadar bu işlemi tekrarlayın. Son durulama için, şişeyi kapatın ve kalan tozu çıkarmak için ters çevirin. Daha sonra, CR1 içeren 15 mililitrelik tüpe altı mililitre CR2 ekleyin.
Son 10 mililitrelik çözeltiyi kabarcıklar eklemeden bir pipetle karıştırın. 200 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanarak, çözelti alt kanal çıkışından çıkmaya başlayana kadar çipin alt kanal girişine 20 mikrolitre CR1 çözeltisi ekleyin. Çözelti üst kanal çıkışından çıkmaya başlayana kadar üst kanal girişinden 50 mikrolitre CR1 çözeltisi ekleyin.
Ardından cipsleri 15 dakika ultraviyole ışık altında bekletin. Maruz kaldıktan sonra, herhangi bir CR1 solüsyonunu üst ve alt kanallardan çıkarın. Her iki kanalı da 100 mikrolitre CR2 solüsyonu ile yıkayın.
Ardından, 100 mikrolitre DPBS ile iki kez yıkayın. Çipin üst ve alt kanalları için hücre dışı matris çözeltilerini hazırlayın. Çıkışta damla görünene kadar alt kanal girişine 50 mikrolitre hücre dışı matris çözeltisi ekleyin.
Ardından, girişte damla görünene kadar üst kanal girişine 50 mikrolitre ekleyin. DPBS'yi talaş yuvası haznesine ekleyin. Kapağı tabağa yerleştirin ve cipsleri gece boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit inkübatörde inkübe edin.
Ertesi gün, çipin epitelini veya üst kanalını 100 mikrolitre önceden ısıtılmış çip genişletme ortamıyla yıkayın. Ardından, endotel veya alt kanalı 100 mikrolitre önceden ısıtılmış HIMEC ortamı ile yıkayın. Saydıktan sonra, endotel kanalına 10 mikrolitre HIMEC ekleyin.
Gerekirse, epitel kanalına organoid büyüme ortamı veya çip genişletme ortamı ekleyin ve HIMEC'lerin tohumlama yoğunluğunu kontrol edin. Daha sonra, çipi hücre kültürü kabına yerleştirilen çip yuvasına ters çevirin, çip kızağındaki rezervuara DPBS ekleyin ve HIMEC'lerin çip zarına yapışmasını sağlamak için çipi iki ila üç saat boyunca 37 santigrat dereceye yerleştirin. İnkübasyondan sonra, talaş kızağını dik konuma getirin.
Endotel kanalını 100 mikrolitre ılık HIMEC ortamı ile ve epitel kanalını organoid büyüme ortamı veya çip genişletme ortamı ile nazikçe yıkayın ve ortamı kanalda bırakın. Enteroidleri hasat etmek için, ortamı nazikçe aspire edin ve hücre kültürü matris hidrojeli içeren kuyucukları 500 mikrolitre ılık DPBS ile yıkayın. Her kuyucuğa 250 mikrolitre soğuk hücre geri kazanım solüsyonu ekleyin ve hücre kültürü matris hidrojelini bozmak için her kuyucuğun altını taze bir pipet ucuyla çizin.
Bozulmuş hücre süspansiyonunu buz üzerinde 15 mililitrelik soğuk bir tüpe ekleyin ve 45 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, süspansiyonu santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Daha sonra, pelete iki mililitre ılık enteroid ayrışma ortamı ekleyin ve tüpü 37 santigrat derece su banyosuna yerleştirin.
60 ila 120 saniye boyunca, daha sonra tüpe 10 mililitre soğuk doku yıkama ortamı ekleyin. Ardından, peleti 200 mikrolitre çip genişletme ortamında yeniden süspanse etmeden önce süpernatanı santrifüjleyin ve çıkarın. Bir P200 pipeti kullanarak enteroidleri ayırın ve süspansiyonu 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne ekleyin.
Hücreleri sayın ve mililitre başına altı kez 10 ila altı hücrelik bir konsantrasyon elde etmek için çip genişletme ortamının hacmini ayarlayın. Ardından, çipin üst kanalına 30 mikrolitre yeniden süspansiyon askıya alınmış hücre süspansiyonu ekleyin. Cipsleri talaş yuvasına geri döndürdükten sonra, hazneye DPBS ekleyin ve cipsleri gece boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.
Ertesi gün, epitel kanalını iki kez 100 mikrolitre çip genişletme ortamı ve endotel kanalını 100 mikrolitre HIMEC ortamı ile yıkayın. Ardından, üst kanal giriş haznesine iki mililitre talaş genişletme ortamı ve üst kanal çıkış haznesine 300 mikrolitre ekleyin. Alt kanal giriş haznesine iki mililitre HIMEC ortamı ve alt kanal çıkış haznesine 300 mikrolitre ekleyin.
Bölmeleri hazırlayın ve çipleri bölmelere ekleyin. Ardından bölmeleri kültür modülüne ekleyin. Saatte 30 mikrolitrelik bir akış hızı ayarlayın ve döngüyü başlatın.
Bir çip üzerinde yenidoğan bağırsağı kullanılarak büyütülen bağırsak epitel hücreleri, birleşik bir hücre tek tabakası oluşturdu ve daha sonra olgun üç boyutlu villus benzeri yapıya dönüştü. Şiddetli nekrotizan enterokolitli bir yenidoğandan bir çip modelinde yenidoğan bağırsağına disbiyotik bir mikrobiyomun eklenmesi, kontrole kıyasla TNF-alfa ekspresyonunun arttığını gösterdi.
