Drosophila larva karkasları etiketli antikoru bir cam slayt üzerine% 0.2 PBST'ye yerleştirerek başlayın. Stereo mikroskop altında, larva karkasının iç yüzeyinin yukarı bakması sağlanacak şekilde ayarlanır. Bir mendil kullanarak fazla PBST çözeltisini emdirin.
Ardından bir damla Anti-Fade montaj ortamını nazikçe ekleyin. Daha sonra, kabarcık oluşumunu önleyerek, disseke edilen larvaları yavaşça ve nazikçe kaplayan slaydın üzerine bir örtü fişi yerleştirin. Kenarlarına oje sürerek kapak fişini yerine sabitleyin.
Floresan zayıflamasını en aza indirmek için slaydı karanlık bir yerde saklayın. Görüntü elde etmek için, 63x Yağa daldırma objektifli lazer taramalı konfokal mikroskobu kullanın. Ardından, deneyin gereksinimlerine en iyi şekilde uyacak şekilde dalga boyunu ve lazer gücünü ayarlayın.
Nöromüsküler kavşakları tanımlamak ve A üç segmentindeki dördüncü kasın görüntülerini yakalamak için, alfa tubulin veya Futsch'u etkinleştirmek için 488 nanometre lazer ve HRP görüntüleme izini etkinleştirmek için 546 nanometre seçin. 1.024 x 1.024 piksel çerçeve boyutu, 1.0 dijital yakınlaştırma ve 0.8 mikrometre görüntüleme aralığı elde etmek için parametreleri değiştirin. Kastaki mikrotübülleri görselleştirmek için, daha az trakeal dala sahip olduğu için A üç ila beş segmentindeki iki kasın görüntülerini yakalayın.
Alfa tübülini etkinleştirmek için 488 nanometre lazer ve T3605 görüntüleme izini etkinleştirmek için 633 nanometre lazer seçin. Görüntüleme parametrelerini 1.024 x 1.024 piksel kare boyutuna, 2,0 dijital yakınlaştırmaya ve 0,4 mikrometre görüntüleme aralığına ayarlayın. Nöromüsküler kavşağın hem pre-pre-hem de post-sinaptik mikrotübül organizasyonları anti-alfa tübülin ile etiketlendi.
Futsch boyama, pre-sinaptik nöronlardaki stabil mikrotübüllerin bolluğunu yansıtıyordu. Presinaptik nöronlarda protein Katanin 60'ı kesen mikrotübüller aşırı eksprese edildiğinde anti-Futsch'un sinyal yoğunluğunun azaldığı gözlendi. Akson gövdesinin boyama yoğunluğu dallarınkinden daha güçlüydü.
Katanin 60 mutasyonları, mikrotübül döngülerinin artmasına neden oldu. Katanin 60'ın aşırı ekspresyonu, terminal düğmeleri içinde kısa mikrotübül parçalarına neden oldu. Alfa tübülin boyama, çekirdeğin etrafında açık bir mikrotübül ağı gösterdi.
Kas hücreleri, önemli ölçüde artmış perinükleer mikrotübüler yoğunluğa sahipti ve Katanin 60 mutantında daha güçlü demetler sergiledi. Aşırı ekspresyon, mikrotübül liflerinin parçalanmasına neden oldu.
