Generating Kidney Organoids from Induced Pluripotent Stem Cell Suspension Culture

Yedinci kültür gününde iPSC hücre süspansiyonundan aşama II ortamını çıkararak başlayın. Şimdi hücreleri iki mililitre DPBS ile yıkayın. Her oyuğa bir mililitre hücre ayırma solüsyonu pipetleyin.

Ardından plakayı beş dakika boyunca 37 derecede bir inkübatöre yerleştirin. İnkübasyondan sonra, hücrelere bir mililitre aşama II ortamı ekleyin ve hücreler yüzeyden ayrılana kadar iyice karıştırın. Hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpte toplayın, ardından oda sıcaklığında üç dakika boyunca 400 g'da santrifüjleyin.

Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı atın ve hücre peletini iki mililitre aşama III ortamında yeniden süspanse edin. Çözeltiyi yavaşça karıştırın. Şimdi süspansiyonu bire üç oranında altı kuyulu, düşük yapışma özelliğine sahip bir plakaya yerleştirin.

Plakayı,% 5 karbondioksit ile 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir inkübatörde bir orbital çalkalayıcı üzerine yerleştirin. Süspansiyon kültüründeki ortamı çıkarmak için, önce aseptik makas kullanarak bir mililitrelik pipetin ucunu kesin. Ardından, organoidleri merkezileştirmek için altı oyuklu plakayı hafifçe çalkalayın.

Daha sonra, organoidleri önceden hazırlanmış pipetlerle aspire edin ve 15 mililitrelik bir tüpe yerleştirin ve beş dakika bekletin. Organoidlerin tüpün tabanında kalmasını sağlayarak süpernatanı aspire edin. Ardından aşama III ortamını plakaya pipetleyin.

Organoidleri yeniden süspanse etmek için karışımı pipetleyin. Organoidleri altı kuyulu, düşük yapışma özelliğine sahip bir plakaya geri koyun. Düşük yapışma özelliğine sahip plakayı inkübatörde dakikada 60 devirde sallamaya devam edin.

12. günde, ortamı aşama IV ortamı ile değiştirin. Böbrek organoidleri tübüler benzeri yapılar sergiler ve 18 günlük agregasyondan sonra parlak alan görüntülerinde kolayca gözlenir. CD31 endotel hücreleri indüklendi.

Dekstran, böbrek organoidlerinin proksimal tübüllerine alındı.