Hücreleri içeren elektron mikroskobu ızgaralarını dondurmadan önce, ızgaraları ters çevrilmiş bir optik mikroskop altında inceleyin. Daldırmalı dondurma sırasında lekelenme sürelerini ayarlamak için her ızgaradaki hücre yoğunluklarını kaydedin. İki ila üç mililitre fosfat tamponlu salin veya PBS'yi 37 santigrat derecede boş bir tabakta ısıtın.
Altın referans hazırlığı için, 50 mikrolitre 10 nanometre kolloidal altın boncuk çözeltisini temiz bir 1,5 mililitrelik tüpe pipetleyin. İçine iki mikrolitre sığır serum albümini eklenir ve tekrar tekrar mikro pipetleme ile homojenize edilir. Tüpü 15.000 ila 20.000 G'de 15 dakika santrifüjleyin.
Bir mikro pipet kullanarak peleti bozmadan süpernatanı dikkatlice çıkarın. Peletleri 50 mikrolitre PBS'de tekrar süspanse edin ve daha önce gösterildiği gibi tüpü tekrar santrifüjleyin. 10 mikrolitrelik bir uç kullanarak dört mikrolitre peleti aspire edin ve 1,5 mililitrelik temiz bir tüpe aktarın.
Çevre odasını %95 nem ve 30 santigrat dereceye ayarlayın. Beşe 15 cımbız kullanarak bir ızgara seçin ve PBS ile yıkayın. Yıkanan ızgarayı dalma cımbızına aktarın.
Izgara sabitlendikten sonra, beşe 15 cımbızı çıkarın ve cl'yi kaydırınamp dalma cımbızın üzerine. cl'yi tutarken ızgarayı dalma dondurucusuna yerleştirin.amp güvenli. Izgaranın arka tarafına bir mikrolitre altın referans ekleyin.
Ardından ızgaranın karbon tarafına iki ila üç mikrolitre PBS ekleyin. Dondurmayı sıvı etana daldırmadan önce ızgaranın arka tarafını lekelemek için otomatik lekelemeyi kullanın. Transfekte edilmiş U2OS hücrelerinin kriyo korelasyon ışığı ve elektron mikroskobu görüntüsü, HIV üreten hücrelerin varlığını ortaya çıkardı.
Bir elektron kriyo tomografi görüntüsü, U2OS hücrelerinin plazma zarından tomurcuklanan çok sayıda HIV partikülü gösterdi.
