Başlamak için, monte edilmiş mikro sim cihazını steril hortum kelepçelerine yerleştirin. Cihazı büyük bir steril Petri kabında kültürleyin. Ekstra nem için, steril suyla dolu 50 mililitrelik konik bir tüp kapağı yerleştirin.
Cihazı hücre kültürüne hazırlamak için üst hazneyi 100 mikrolitre su ile durulayın. Daha sonra, kollajen dört, sığır fibronektini ve steril suyu karıştırarak bir kaplama çözeltisi hazırlayın. Suyu üst hazneden çıkarın ve 100 mikrolitre kaplama solüsyonu ekleyin.
Odayı 37 santigrat derecede iki ila dört saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, üst haznedeki kaplama çözeltisini 100 mikrolitre oda sıcaklığında HECSR ile değiştirin. Alt hazneye 20 mikrolitre HECSR çözeltisi ekleyin.
EECM-BMEC benzeri hücrelerden geçmek için, hücrelere bir hücre ayırma enzim karışımı ekleyin ve 37 santigrat derecede beş ila sekiz dakika inkübe edin. Daha sonra, hücre süspansiyonunu pipetleyin ve bir santrifüj tüpündeki endotel ortamının hacminin dört katına ekleyin. Beş dakika boyunca 200G'de santrifüjleyin ve hücreleri bir mililitre HECSR'de yeniden süspanse edin.
Hücreleri, üst bölmede santimetre kare başına 40.000 hücre yoğunluğunda tohumlayın ve hücre yapışmasını kolaylaştırmak için iki ila dört saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyondan sonra, ortamı her iki odada da taze HECSR ile değiştirin. Alt hazneye eksi 20 santigrat derecede soğutulmuş 20 mikrolitre %100 metanol ve üst hazneye 50 mikrolitre ekleyerek hücreleri sabitleyin.
Cihazı oda sıcaklığında iki ila 10 dakika inkübe edin. Daha sonra, alt hazneye 20 mikrolitre PBS ve üst hazneye 100 mikrolitre ekleyerek hücreleri yıkayın. Her yıkamadan sonra, alt haznede kabarcık olmadığını onaylayın.
Alt hazneye 20 mikrolitre ve üst hazneye 50 mikrolitre bloke edici solüsyon ekleyerek hücreleri 30 dakika bloke edin. Bloke ettikten sonra, üst haznedeki hacmi 50 mikrolitre primer antikor çözeltisi ile değiştirin ve oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. PBS yıkamadan sonra, üst hazneye 50 mikrolitre ikincil antikor çözeltisi ekleyin ve ışıktan korunarak bir saat inkübe edin.
PBS yıkamadan sonra, üst hazneye 50 mikrolitre Hoechst ekleyin ve üç dakika inkübe edin. Daha sonra alt hazneye 20 mikrolitre PBS ve üst hazneye 100 mikrolitre ekleyin. Cihazı hemen konfokal bir mikroskopta görüntüleyin.
Islak uzun çalışma mesafesi 40x objektif kullanarak membran penceresini bulun ve Hoechst ve bağlantı lekelenmesini kontrol etmek için floresan kanallarına geçin. HIPSC hücre kültürü ve tohum altı BPLC için optimal oturma yoğunlukları burada gösterilmiştir. HIPSC'den türetilen ko-kültürün faz kontrast görüntülemede ayırt edilmesi, primer ko-kültürlere göre daha kolaydı.
Düşük BPLC tohumlama, zayıf parazit kapsamı ve topaklanma ile sonuçlanırken, aşırı yeme parazit tabakasının zardan soyulmasına neden olur. İmmün boyanmış HIPSC türevli hücre ko-kültüründe, sadece ince bir silikon nitrür nanomembran ile ayrılmış, birbirine yakın iki hücre tabakası görüldü. Geçirgenlik testinde, iki gün boyunca kültüre edilen endotel hücrelerinin geçirgenliğindeki yüksek değişkenlik, iki günlük kültürün bariyer olgunlaşması için yetersiz olduğunu göstermektedir.
Ayrıca, dört günden itibaren bariyer olgunlaşması üzerine laboratuvarlar arasında geçirgenlik açısından önemli bir fark yoktu.
