Başlamak için, ilgilenilen uzun kodlamayan RNA'yı elde ettikten sonra, hibridizasyon tamponunu iki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, dört optik yoğunluk probunu 160 mikrolitre dietil pirokarbonat ile arıtılmış deiyonize suda ışıktan uzakta çözün. Her kuyucuk için 200 mikrolitre prob karışımı hazırlayın ve mililitre başına 50, 25, 12.5 ve altı mikrogramlık bir seri oluşturun.
Prob karışımını beş dakika boyunca 73 santigrat derecede denatüre edin. Steril cam kapak fişleri üzerinde 143B hücreleri içeren 12 oyuklu bir hücre kültürü plakası alın. Ortamı çıkarın ve PBS ile beş dakika boyunca iki kez yıkayın.
Hücreleri bir çalkalayıcıya yerleştirin. Daha sonra PBS'yi çıkarın ve her bir kuyucuğa 200 mikrolitre% 100 etanol ekleyin, oda sıcaklığında 15 dakika sabitleyin. Daha sonra etanolü çıkarın, her bir oyuğa 200 mikrolitre% 0.1 Triton X-100 ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
% 0.1 Triton X-100'ü çıkarın ve PBS ile beş dakika boyunca iki kez yıkayın. Daha sonra, PBS'yi çıkarın, her bir oyuğa 200 mikrolitre iki kez sodyum-salin sitrat veya SSC tamponu ekleyin ve 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. İki kez SSC tamponunu çıkarın, her bir oyuğa 200 mikrolitre% 70 etanol ekleyin ve oda sıcaklığında üç dakika inkübe edin.
% 70 etanolü atın, ardından her bir oyuğa 200 mikrolitre% 85 etanol ekleyin ve oda sıcaklığında üç dakika inkübe edin. Daha sonra,% 85 etanolü atın, her bir oyuğa 200 mikrolitre% 100 etanol ekleyin ve oda sıcaklığında üç dakika inkübe edin. Daha sonra, %100 etanolü emip atın ve kuyuların kurumasını bekleyin.
Daha sonra, her bir oyuğa 200 mikrolitre denatüre prob karışımı ekleyin, ardından gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, numuneleri 37 santigrat dereceden çıkarın, prob karışımını atın ve her bir kuyucuğa 200 mikrolitre önceden ısıtılmış 0.4 kez SSC% 0.3 Tween 20 tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında iki dakika yıkayın. 0,4 kat SSC %0,3 Tween 20 arabelleğini çıkarın.
Her bir kuyucuğa 200 mikrolitre iki kez SSC% 0.1 Tween 20 tampon ekleyin ve oda sıcaklığında iki dakika yıkayın. Ardından, iki kez SSC %0,1 Tween 20 arabelleğini atın. 200 mikrolitre DAPI boyama solüsyonu ekleyin ve karanlıkta bir çalkalayıcı üzerinde 20 dakika boyayın.
Boyamadan sonra, DAPI çözeltisini atın ve oda sıcaklığında iki dakika boyunca PBS ile yıkayın. Son olarak, slayta 50 mikrolitre sakız içeren montaj ortamı ekleyin ve slaytı sabitlemek için cam kapak kızağını yerleştirin. İnsan osteosarkom hücrelerinde temsili SNHG6 FISH görüntüleri gösterilmektedir.
Kırmızı floresan yayan Cy3 ile etiketlenmiş SNHG6 probu, SNHG6'nın esas olarak sitoplazmada lokalize olduğunu gösterdi. Yüksek konsantrasyonda prob kullanıldığında bir arka plan rengi gözlendi.
