Başlamak için, kapak ucunu 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpünün konik tabanından 0,5 milimetre kesmek için ağır hizmet tipi makas veya makas kullanın. Orta deliği kapatmak için kesilen boruya bir parça cam yünü yerleştirin. Monte edilmiş bir cam yünü filtre ünitesini steril bir 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne yerleştirin ve tüpü etiketleyin.
Ardından, eteksiz 96 oyuklu bir PCR plakasını altı adet iki sütunlu destek rafına kesin. İki sütunlu rafları, kuyuların konik tabanları yukarı bakacak şekilde çevirin. Rafı nemli filtre kağıdı içeren bir cam Petri kabına yerleştirin ve yaprak kılıfları için bir nem odası oluşturmak için kapakla örtün.
Conidia'yı sporlu Colletotrichum graminicola'dan hasat etmek için, plakaya üç ila dört mililitre steril deiyonize su ekleyin. Steril bir konik uçlu tokmak kullanarak, sporları agardan gevşetmek için tüm plaka boyunca eşit şekilde kazıyın. Bir cam yünü filtre ünitesine aseptik olarak bir mililitre spor süspansiyonu ekleyin ve sporların yerçekimi ile toplama tüpüne akmasına izin verin.
Filtrelenmiş spor süspansiyonunu beş dakika boyunca 3.500 G'de santrifüjleyin ve sıvıyı otoklavlanabilir bir kaba dökün. Toplama tüpüne bir mililitre steril deiyonize su ekleyin ve peletlenmiş sporları yeniden süspanse etmek için hafifçe çalkalayın. Yine, süspansiyonu santrifüjleyin ve 300 ila 500 mikrolitre deiyonize suda miktar tayini için sporları yeniden süspanse edin.
Spor konsantrasyonunu belirlemek için 100 kat büyütmede bileşik mikroskop altında bir hemositometre kullanın. Daha sonra deiyonize su ile mililitre süspansiyon başına 500.000 spor hazırlayın. Kılıfı ilk gerçek yapraktan çıkarmak için iki aşamalı fidan.
Kılıfın üst üste binen kenarı boyunca bir küçük resim çalıştırın ve oluktan yavaşça gevşetin. Geri kazanılan yaprak kılıfını üç ila beş santimetrelik bölümler halinde kesin. İç epidermal tabakayı ortaya çıkarmak için her bir parçayı dikkatlice açın.
Orta kaburganın üzerindeki kılıfın ortasındaki iç yüzeye 20 mikrolitre mantar sporu süspansiyonu uygulayın. Aşılanmış yaprak kılıflarını, orta nervürü altta olacak şekilde yatay olarak, nemlendirilmiş filtre kağıdı içeren bir cam Petri plakasına yerleştirin. Daha sonra küçük nem odalarını nemli çimlenme kağıdıyla kaplı şeffaf bir saklama kutusuna yerleştirin, saklama kutusunu bir kapakla kapatın ve istenen süre boyunca sürekli aydınlatma altında 23 santigrat derecede inkübe edin.
Kılıflardaki hastalık belirtileri için kutuları düzenli olarak kontrol edin.
