Başlamak için, bir neşter ile, oksipitalden sakral bölgeye ötenazi yapılmış bir farenin dorsal orta hattı boyunca bir kesi yapın. Stereoskopik bir cerrahi mikroskop kullanarak, lomber omurgaya kadar katmanları dikkatlice inceleyin. Son kostal kemeri tanımlayın.
Son servikal vertebrayı ve sakrumu tanımlayın. Sonra omurgayı ayırmak için bir kesim yapın. Bir çift diseksiyon forseps ile, omuriliği çıkarmak için omurun dorsal laminektomisini gerçekleştirin.
Periferik sinir sistemini oluşturan foramina yoluyla çıkan sinirleri çıkarın. Şimdi, çıkarılan omuriliği bir diseksiyon tahtasına yerleştirin. Bir çift vannas makası ile iki milimetre büyüklüğünde parçalar halinde kesin.
Ardından parçaları iki mililitrelik düz tabanlı bir mikrotüpe aktarın. Mikrotüpe bir mililitre HBSS-LD çalışma solüsyonu ekleyin. Karışımı 37 santigrat derecede 25 dakika inkübe edin.
Karışımı her beş dakikada bir kuvvetlice girdapladığınızdan emin olun. Ardından, her bir sindirimin içeriğini 40 mikron büyüklüğünde bir süzgeçten geçirin. Daha sonra sindirimi nötralize etmek ve kalan dokuyu ezmek için% 2FBS ile yedi mililitre HBSS ekleyin.
Süspansiyonu, dört santigrat derecede beş dakika boyunca 220 g'da santrifüjlemeden önce 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Şimdi süpernatanı atmak için bir mililitrelik bir mikropipet kullanın. Daha sonra peleti iki mililitre HBSS-FBS içinde yeni bir 15 mililitrelik konik tüpte yeniden süspanse edin.
Tüpe iki mililitre% 90 izotonik yoğunluk gradyan ortamı ekleyin ve karışımı 18 santigrat derecede 25 dakika boyunca 160 g'da santrifüjleyin. Son olarak, bir transfer pipeti ile interfazı alın ve 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Hücreleri 10 mililitre PBS ile yıkayın, daha sonra deney yapmadan önce hücreleri beş santigrat derecede beş dakika boyunca 220 g'da santrifüjleyin.
Ekstrakte edilen mikroglial hücrelerin saflaştırılması, FACS boyama ile onaylandığı gibi% 99'a kadar hücre verimi verdi. Aktive edilmemiş mikroglia ile tutarlı ortalama 10 mikrometre büyüklüğünde çift pozitif hücreler gözlendi.
