Başlamak için, hazırlanan PBS / BEV çözeltisinden 500 mikrolitre alın. Üç mililitre PBS ile birleştirin ve 1.000 mikrolitrelik bir pipet kullanarak hafifçe karıştırın. Delikli bir köpük plaka üzerine 31 mililitrelik bir ultrasantrifüj tüpü yerleştirin ve tüpü aşağı doğru bir okla etiketleyin.
Daha sonra 1.000 mikrolitrelik bir pipeti dikey olarak tutun ve tüpün dibine üç mililitre% 50 iyodiksanol çözeltisi ekleyin. Tüp açıklığının altındaki köpük plaka seviyesinin biraz üzerine bir tüp tutucu yerleştirin ve tüpü 70 derecelik bir açıyla eğin. 1.000 mikrolitrelik bir pipet kullanarak,% 50 iyodiksanol çözeltisinin üzerine üç mililitre% 40 iyodiksanol çözeltisi ekleyin.
Daha sonra% 40 iyodiksanol çözeltisi üzerine üç mililitre% 20 iyodiksanol çözeltisi koyun. 1.000 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, hazırlanan% 20 iyodiksanol çözeltisinin üzerine üç mililitre% 10 iyodiksanol çözeltisi ekleyin. Daha sonra,% 10 iyodiksanol çözeltisinin üzerine 3,5 mililitre PBS / BEV çözeltisi ekleyin ve tüpleri yavaşça dik konuma getirin.
Şimdi, 31 mililitrelik bir ultrasantrifüj tüpünü delikli bir köpük plaka üzerine yerleştirin ve yukarı doğru bir okla etiketleyin. 1.000 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, tüpün dibine dikey olarak 2.5 mililitre% 60 iyodiksanol stok çözeltisi ekleyin ve üç mililitre% 50 iyodiksanol BEV çözeltisi elde etmek için 500 mikrolitre PBS / BEV çözeltisi ile birleştirin. Çözeltiyi pipetleyerek iyice karıştırın.
Daha sonra sırayla %40, 20 ve %10 iyodiksanol çözeltisini katmanladıktan sonra, %10 iyodiksanol çözeltisinin üzerine 3,5 mililitre PBS eklemek için 1.000 mikrolitrelik bir pipet kullanın. PBS'li iki tüpün ağırlığını artı eksi 0,005 gram içindeki toplam ağırlığa ayarlayın. Daha sonra, tüpleri kovalara yerleştirin ve dört santigrat derecede yedi saat boyunca 160.000 G'de santrifüjleyin.
Bir pipetleyici kullanarak, gradyan ultrasantrifüj modundan elde edilen fraksiyonları, yan duvara karşı yukarıdan aşağıya sırayla 10 ayrı 38,5 mililitrelik ultrasantrifüj tüpünde toplayın. Daha sonra fraksiyonları dört santigrat derecede 70 dakika boyunca 160.000 G'de ultrasantrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve ultrasantrifüj tüplerini beş dakika boyunca ters çevirin.
Ardından, 200 mikrolitrelik bir pipet kullanarak peletleri 200 mikrolitre önceden soğutulmuş PBS'de yeniden süspanse edin. PBS/BEV çözeltisini temiz bir 1,5 mililitrelik mikrotüpe aktarın. F1'den F10'a kadar olan kesirleri bir gradyan ultrasantrifüj modundan elde edildiği gibi etiketleyin ve analize devam edin.
