0.5 mililitre log faz klorella vulgaris kültürünü pipetleyerek başlayın. Kültürü Tris-Asetat-Fosfat veya TAP Agar plakasına yayın. Kültürü beş gün boyunca 25 santigrat derecede büyütün.
Daha sonra, 10 mililitre takviye edilmiş LB suyunu, bir çalkalayıcı şişede elektroporasyonlu agrobacterium tumefaciens kültürü ile dolu bir döngü ile aşılayın. Şişeyi gece boyunca 28 ila 30 santigrat derece ve 250 RPM'de inkübe edin. Ertesi gün, gece boyunca kültürün bir mililitresini 50 mililitre takviye edilmiş LB'ye aşılayın. Şişeyi 28 ila 30 santigrat derece ve 250 RPM'de inkübe edin.
Alg ve bakteri kültürlerini birlikte yetiştirmek. İlk olarak, agrobakteri kültürünü 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Tüpü oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 4.000 G'de santrifüjleyin.
Ardından, süpernatanı atmak için pipetleyin ve indüksiyon ortamını kullanarak hücreleri iki kez yıkayın. Daha sonra, Chlorella Vulgaris kültür plakasına 25 mililitre indüksiyon ortamı ekleyin. Hücreleri 50 mililitrelik bir tüpe aktarın, ardından oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 4.000 G'de santrifüjleyin.
Süpernatanı attıktan sonra, alg hücresi peletini 200 mikrolitre bakteri süspansiyonu ile birleştirin. Kombine kültürü döner bir inkübatörde 21 ila 25 santigrat derecede, bir saat boyunca 150 RPM'de çalkalayın. Karışık kültürün 200 mikrolitresini 15 milimol glikoz ile desteklenmiş indüksiyon ortamı plakalarına yayın ve plakaları karanlıkta 21 ila 25 santigrat derecede üç gün boyunca inkübe edin.
Üç gün sonra, mikroalgleri 10 mililitre TAP ortamı kullanarak bir şişeye toplayın. Litre başına 20 miligram tetrasiklin ile desteklenmiştir. Şişeyi karanlıkta iki gün boyunca inkübe edin ve sıcaklığı 21 ila 25 santigrat derece arasında tutun.
Kültürün 500 mikrolitresini, litre başına 20 miligram tetrasiklin ile takviye edilmiş seçici ortam üzerine yerleştirin. Plakaları aydınlatılmış bir odaya kaydırmadan önce iki gün boyunca karanlıkta 21 ila 25 santigrat derecede inkübe edin. Dönüşüm plakasından tek kolonileri seçin ve bunları TAP agar plakalarına çizin.
Koloni PCR'si gerçekleştirmek için, 10 mikrolitre steril suya küçük bir hacimde dönüştürücü alg hücresi ekleyerek başlayın. Çözeltiyi 98 santigrat derecede 15 dakika kaynatın. Benzer şekilde, numunede agrobakteri yokluğunun doğrulanması için başka bir PCR şablonunu işleyin.
Elde edilen parçaların boyutunu doğrulamak için PCR örneklerini merdivenli bir DNA agaroz jeli üzerinde çalıştırın. Dönüştürülmüş koloniler, sefotaksim ile higromisin içeren plakalar üzerinde büyüyebildiler. Yabani tip koloniler plakalarda büyümedi.
Sefotaksimin litresi başına 70 miligrama kadar dirençli koloniler elde edildi. Alg örneklerinde pCAMBIA1302'nin Koloni PCR Amplikonu yoktu. Bununla birlikte, her üç alg örneğinde de amplikonda MGFP5G tespit edildi.
Tekrar tekrar Sefotaksimin alt kültürleri olan alg kültürleri, plazmit yokluğunun göstergesi olan virülans proteini E2'nin yokluğunu gösterdi. Transformantların ve yabani tip suşların alg büyümesinde önemli bir fark gözlendi. Daha düşük büyümeye rağmen, dönüştürücü hücre yoğunluğu için normalleştirildiğinde daha yüksek floresan seviyelerine sahipti.
