Serum örneğinin beş mikrolitresini 96 oyuklu bir plakada 120 mikrolitre tahlil tamponu ile karıştırarak insan serum örneği seyreltmesine başlayın. İlk seyreltmenin 10 mikrolitresini 70 mikrolitre tahlil tamponu ile karıştırarak sekiz kat daha seyreltin. Şimdi, hedef antijene bağlı boncuklar içeren boncuk karışımından 100 mikrolitre hazırlayın.
Daha sonra, hazırlanan boncuk karışımını bir Falcon tüpünde 2.4 mililitre tahlil tamponu ile seyreltin. 25 mikrolitre boncuk süspansiyonunu belirlenen kuyucuklara pipetleyerek serum inkübasyonunu başlatın. Boncuk süspansiyonu ile kuyucuklara 25 mikrolitre 200 kat seyreltilmiş serum ekleyin.
96 oyuklu reaksiyon plakasını bir mikroplaka contası ile kapatın. Daha sonra plakayı bir tabak çalkalayıcı üzerinde boncuklarla inkübe edin. İnkübasyonun ardından, 96 oyuklu reaksiyon plakasını plaka çalkalayıcıdan çıkarın.
Plakayı manyetik bir plaka yıkayıcıya yerleştirin ve yapışkan plaka contasını çıkarın. Ardından, boncukları 100 mikrolitre yıkama tamponu ile üç kez yıkayın, ardından son yıkama adımından sonra son yıkama hacmini boncuklardan aspire edin. İlk antikor inkübasyonu için, tahlil tamponunda taze bir IgG ve IgM ikili tespit reaktif karışımı hazırlayarak başlayın.
Belirlenen her bir kuyucuğa 30 mikrolitre algılama reaktifi pipetleyin, ardından 96 oyuklu reaksiyon plakasını bir mikroplaka contası ile kapatın. Plakayı bir plaka çalkalayıcı üzerinde 20 santigrat derecede dakikada 750 devirde 45 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, plakayı manyetik bir plaka yıkayıcıya yerleştirin ve plakaları daha önce olduğu gibi yıkadıktan sonra her reaksiyona 30 mikrolitre seyreltilmiş BV421 etiketli striptavidin yapışkan plaka conta pipetini çıkarın.
Ardından, sonraki inkübasyon için kapalı plakayı bir plaka çalkalayıcıya yerleştirin. İnkübasyon tamamlandıktan sonra, plakayı yıkayın ve yıkama tamponunu kullanarak kuyucuklardaki boncukları 100 mikrolitrelik son hacme kadar yeniden süspanse edin. Sonuçları analiz etmek için, 96 oyuklu reaksiyon plakasını bir mikroplaka contası ile kapatın.
Daha sonra, kapalı plakayı bir plaka çalkalayıcı üzerinde dakikada 1000 devirde 20 santigrat derecede üç dakika inkübe edin. Plakayı çalkalayıcıdan çift raportörlü akış analizörü cihazına aktarın. Son olarak, üreticinin talimatlarını izleyerek numune medyan floresan yoğunluğunu veya MFI'yi değerlendirin.
Üç temsili Borrelia antijeni için Spearman korelasyon analizi, insan serumlarında bulunan anti-Borrelia antikorlarını tespit ederken MFI değerlerinin tek tip tekrarlanabilirliğini gösterdi. İkili raportör tahlili, Levey-Jennings çizelgeleri tarafından gösterilen yüksek tahliller arası hassasiyet ile iyi tahlil-tahlil tekrarlanabilirliği gösterdi. 100 kat ila 12.800 kat arasındaki numune dilüsyonlarında, hem IgM tespiti hem de IgG tespiti için seyreltme eğrileri her iki cihaz için de benzerdi.
MFI değerleri tek raportör enstrümanda biraz daha yüksekti.
