Başlamak için, iki yeni faks tüpünü bir ve iki karışık tüpler olarak etiketleyin. Akış sitometrik analizi için hücre ve antikor süspansiyonunu verilen tabloya göre hazırlayın. Tüpleri 30 dakika inkübe ettikten sonra, her tüpü bir mililitre boyama tamponu ile iki kez yıkayın.
Girdaplı tüpleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 200 G'de santrifüjleyin. Ardından peleti 500 mikrolitre boyama tamponunda tekrar askıya alın. 48 oyuklu bir plakanın kuyularını 200 ila 500 mikrolitre FBS ile kaplayın ve bir saat bekletin.
Ardından, kalan FBS'yi çıkardıktan sonra 200 ila 500 mikrolitre %10 MSC ortamını pipetleyin. Numuneleri tek hücreli ayırmaya hazırlamak için, bir mililitre FBS'yi iki yeni faks tüpüne pipetleyin. Tüpün iç yüzeyinde eşit bir FBS tabakası oluşturmak için tüpleri yuvarlayın.
Ayırma deneyi için hücre ve antikor süspansiyonunu tabloya göre bir ve iki karışık tüplerde hazırlayın. Daha sonra tüpleri karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Boyama tamponu ile yıkadıktan sonra, tüpleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 200 G'de santrifüjleyin.
Daha sonra peleti 500 mikrolitre boyama tamponunda tekrar süspanse edin ve ayırmadan önce beş mikrolitre DAPI'de 15 dakika inkübe edin. Kompanzasyon matrisini ayarlamak için tek leke kompanzasyon tüplerini kullanın. Cihaz yazılımındaki araç çubuğundan deney'e tıklayın.
Ardından ücret kurulumuna tıklayın ve ardından ücret kontrolleri oluşturun. Ardından, boyanmamış tüpe ve ardından sitometre iletişim kutusundaki parametrelere tıklayın. Her parametre için değerleri düzenleyerek voltajları ayarlayın.
Edinme panosunda yükle'ye tıklayın ve ardından edin'e tıklayın. P-1 kapısını hücre popülasyonuna sürükleyin ve her parametre için voltajı ve negatif kapıyı ayarlamak için tüm kompanzasyon kontrollerine uygulayın. Şimdi tek leke dengeleme tüplerini ayrı ayrı yükleyin.
Verileri kaydedin ve kaydedin. Geçerli denemeyi seçin, üzerine sağ tıklayın ve ücret değerlerini hesapla'yı seçin, ardından bağla ve kaydet'i seçin. Karışık tüpü çalıştırın ve 10.000 hücre kaydedin.
Uygun geçit stratejisiyle sıralanacak ilgilenilen nüfusa kapıları ayarlayın. Ardından, cihaza bir toplama plakası yükleyin ve oyuk başına 2.500 ila 5.000 hücre arasında değişen bir hedef hücre numarası ayarlayın. Ardından tek hücreli sıralama saflık maskesini seçin.
Sıralanan hücre popülasyonlarını bir toplama cihazında toplayın ve sıralama deneyi süresince buz üzerinde tutun. Son olarak, kültürleri 37 santigrat derecede tutmak için plakaları %5'lik bir karbondioksit inkübatörüne kaydırın. Çoklu parametrik akış sitometri deneyleri grafikleri, CD 90 FITC antikorlarının FITC izotipinin ekspresyonunu göstermedi.
CD-90 ve CD-73 belirteçlerinin pozitif ekspresyonu ve CD-45'in negatif ekspresyonu, boyanmamış ve FMO kontrollerininkiyle karşılaştırılabilir. İmmünofenotipler, ISCT tarafından önerilen belirteçler ve CD-44 ile erken pasajlardan birinden belirteç dağılımını gösterdi ve ana popülasyonları MSC'ler olarak belirledi. Geç geçiş hangarları, yüksek ve loş ekspresörlerin tek hücreli tasnifi için kullanılmıştır.
48 oyuklu plakada toplanan post sıralanmış hücreler, ana popülasyonları gibi yapışma ve çoğalma gösterdi. Sıralanan hücreler, adipojenik büyüme faktörlerinin varlığında farklılaştı.
