İki silikon plakayı otoklavladıktan sonra, steril koşullar altında plakaları otoklav torbasından çıkarın ve 150 milimetrelik plakalara yerleştirin. Silikon plakaların her bir oyuğuna 400 mikrolitre fibronektin çözeltisi ekleyin. Daha sonra, MSC ortamında skleraksi pozitif indüklenen mezenkimal stromal hücreleri yeniden süspanse edin ve otomatik bir hücre sayacı kullanarak canlı hücreleri sayın.
Santimetre kare başına 1.25 çarpı 10 ila dördüncü hücre elde etmek için gereken hücre süspansiyon hacmini hesaplayın. Bu hacimdeki MSC streç ortamını 15 mililitrelik konik tüpten çıkarın ve gerekli hacimde skleraksi pozitif indüklenmiş mezenkimal stromal hücre süspansiyonunu ekleyin. Yeni hücre süspansiyonunun homojenliği için tüpü ters çevirin.
Her iki silikon plakanın her bir oyuğuna 400 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin. Kapağı 150 milimetrelik plakalara geri koyun ve plakaları 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Tek eksenli gerginlik için, germe aparatını çift damıtılmış su ve ardından% 70 etanol ile durulayın.
Cihazı silin, hücre kültürü başlığına yerleştirin ve 15 dakika boyunca ultraviyole ışığa maruz bırakın. Ardından, inkübatöre statik kontrol olarak bir plaka yerleştirin. Silikon plaktaki delikler ile vidaları hizalayarak ikinci oturan silikon plağı germe aparatına yerleştiriniz.
Ardından kapağı aparatın üzerine yerleştirin. Oturmuş silikon plakalı aparatı elektronik kaynağa takın ve 37 santigrat derecede inkübatöre yerleştirin. Döngüsel germe programını günde iki saat boyunca 0,5 hertz'de% 4 sinüzoidal gerilime ayarlayın.
Başlat düğmesine basarak gerdirmeyi başlatın. Skleraksis pozitif indüklenen mezenkimal stromal hücrelerin mekanik yüklenmesi sırasında, aşırı yüksek tohumlama yoğunlukları erken hücre kasılmasına ve erken hücre ölümüne yol açtı. Birkaç günlük gerilmeden sonra, statik gruptaki rastgele hücre organizasyonuna kıyasla, skleraksis pozitif indüklenmiş mezenkimal stromal hücreler gerilmiş grupta bir dereceye kadar hücre organizasyonu gözlendi.
Akton filamentlerinin falloidin boyama, statik plakalarda gözlenen rastgele hücre organizasyonunun aksine, hücrelerin gerilme yönüne dik olarak büyüdüğünü gösterdi. Gen ekspresyon analizi, sadece sıfırıncı gündeki IMSC'lere kıyasla, hem üç hem de yedi günde tenojenik genlerde önemli bir yukarı regülasyon ortaya çıkardı. Yedi günlük gerilme sonrası ortamda kollajen birikimi, skleraksi pozitif indüklenen mezenkimal stromal hücreler gerilmiş grupta diğer tüm gruplara göre anlamlı olarak daha yüksekti.
