Başlamak için, EV tuzağı yaklaşımını kullanarak insan idrarından elde edilen kurutulmuş hücre dışı vezikül örneğini alın. Gösterilen bileşenlerle yeni bir lizis tamponu hazırlayın. Ardından, kurutulmuş EV örneğini çözündürmek için 100 mikrolitre lizis tamponu ekleyin.
Numuneyi 1.100 RPM'de çalkalarken 95 santigrat derecede 10 dakika ısıtın. Numuneyi oda sıcaklığına soğuttuktan sonra, 400 mikrolitre 50 milimolar TEAB ekleyerek beş kat seyreltin. Üreticinin talimatlarına göre bir BCA test kiti kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün.
Numuneye tripsin ve lizin C karışımı ekleyin, gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin ve 1.100 RPM'de çalkalayın. Ardından numuneyi asitleştirmek için 50 mikrolitre %10 trifloroasetik asit veya TFA ekleyin. Ayrıca, numunelere 600 mikrolitre etil asetat ekleyin ve karışımı iki dakika boyunca vorteksleyin.
Numuneyi 20.000 G'de üç dakika santrifüjleyin ve arayüzü bozmadan üst tabakayı dikkatlice çıkarın. Bir vakumlu santrifüj yoğunlaştırıcı kullanarak sulu fazı kurutun. Şimdi peptitleri asitleştirmek için kurutulmuş numuneyi 200 mikrolitre% 0.1 TFA içinde yeniden süspanse edin.
Numuneyi tuzdan arındırmak için bir CA18 tuz giderme ucu kullanın ve 200 mikrolitre %0,1 TFA ve %80 asetonitril ile şartlandırın, ardından 200 mikrolitre %0,1 TFA ile iki yıkama yapın. Asitlendirilmiş peptit örneğini uca yükleyin ve 200 mikrolitre% 0.1 TFA ile üç kez yıkayın. Peptitleri 200 mikrolitre% 0.1 TFA ve% 80 asetonitril ile elute.
Eluenti gösterildiği gibi çizdikten sonra, fosfopeptit zenginleştirmesi için kurutulmuş ila fosfoproteomik numuneyi 200 mikrolitre yükleme tamponunda yeniden süspanse edin. Numuneye 50 mikrolitre boncuk ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika kuvvetlice çalkalayın. Numuneyi boncuklarla birlikte fritlenmiş uca yükleyin ve 100 G'de bir dakika santrifüjleyin, ucu art arda 200 mikrolitre yükleme tamponu ile yıkayın, tamponları bir ve iki yıkayın.
Kaçan fosfopeptitleri toplamak için ucu boncuklarla yeni bir tüpe yerleştirin. Uca 50 mikrolitre elüsyon tamponu ekleyin ve 20 G'de iki dakika santrifüjleyin, ardından bir vakumlu santrifüj yoğunlaştırıcı kullanarak ellerinden kaçan fosfopeptitleri kurutun.
