Başlamak için, EVtrap yaklaşımını kullanarak idrar örneklerinden izole edilen hücre dışı veziküllerin proteom ve fosfoproteom örneklerini hazırlayın. Numuneleri, sıvı kromatografi sistemi aracılığıyla sıkışmış iyon hareketliliği uçuş süresi kütle spektrometresine enjekte edin. Peptitleri 15 santimetrelik bir C18 kolonuna ayırın.
Proteomik analiz için, rampa başına kütle aralığı 300 ila 1200 kütle-yük oranı ve 0,6 ila 1,50 1/Knot arasında iyon hareketliliği sabiti ile dia-PASEF yöntemini kullanarak veri elde edin. Fosfoproteomik analiz için, bir dia-PASEF toplama yöntemi kullanarak veri elde edin. Rampa başına kütle aralığını, 0,6 ila 1,50 1/Knot arasında iyon hareketliliği sabitinde 400 ila 1550 kütle-yük oranını kapsayacak şekilde ayarlayın.
Ham dosyaları proteomik yazılıma yükleyin. Homo sapiens veritabanında arama parametrelerini ayarlayın. Özet Türü için Spesifik'i seçin ve Enzimler'in altında TrypsinP'yi seçin.
Peptit Uzunluğunu minimum 7 ve maksimum 52 olarak tanımlayın ve iki kaçırılan bölünmeye izin verin. Ardından Maksimum Değişken Değişikliklerini 5 olarak ayarlayın. Sabit Modifikasyon, Sistin üzerinde Karbamidometil olmalı, Değişken Modifikasyonlar ise Asetil Protein N-Terminali, Metiyoninde Oksidasyon ve Serin, Treonin ve Tirozin'de Fosforilasyon içermelidir.
Son olarak, peptit spektrum eşleşmesi, peptit ve protein grubu için yanlış keşif oranını 0.01 olarak ayarlayın. LCMS ve MS proteomik profillemesinde, her numunenin% 2'si yaklaşık 2.200 proteinden 11.000'den fazla benzersiz peptit ortaya çıkardı. Özellikle, benzersiz proteinlerin %72'si her üç kopyada da tutarlı bir şekilde bulundu ve ExoCarta veritabanına kıyasla 90 üst EV belirteci ve proteini tanımlandı.
Kantitatif kesinlik, yüksek tekrarlanabilirlik ve güvenilirliği simgeleyen %5,7'lik düşük-orta varyasyon katsayısı ile doğrulandı. Fosfoproteomik için, her peptit örneğinin %98'i 800 benzersiz fosfopeptit ve 350 fosfoprotein verdi. Zenginleştirme, %72 fosfosperin, %22 fosfotreonin ve %6 fosfotirozin peptitleri ile sonuçlandı.
Fosfopeptitlerin% 42'si, kabul edilebilir kantitatif tekrarlanabilirliği gösteren% 21.8'lik bir orta varyasyon katsayısında tüm kopyalarda tanımlandı.
