Serolojik bir pipet kullanarak, 15 mililitrelik bir santrifüj tüpünde sekiz mililitre yoğunluk gradyan ortamı üzerine dört mililitre heparinize insan kanını dikkatlice katmanlayın. Kanı 550G'de 20 santigrat derecede 30 ila 50 dakika santrifüjleyin. Ardından, plazma ve mononükleer hücreler içeren üst tabakayı çıkarmak için bir mililitrelik bir pipet kullanın.
Alt bulutlu banttan ve berrak sıvının yaklaşık üç ila dört mililitre altındaki nötrofilleri, 10 mililitre PBS içeren 15 mililitrelik bir santrifüj tüpünde toplayın. Nötrofil süspansiyonunu karıştırmak için tüpü iki ila üç kez hafifçe ters çevirin. Nötrofil süspansiyonunu 400G'de 20 santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin, ardından süpernatanı tüpten dikkatlice boşaltın ve peleti beş mililitre PBS'de yeniden süspanse edin.
Yine, süspansiyonu 300G'de 20 santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkardıktan sonra, tüp duvarında ve tüp ağzının çevresinde kalan süpernatanı ortadan kaldırmak için vakumlu emme kullanın. Peletin bir mililitre nötrofil ortamında yeniden süspanse edilmesi.
Mililitre antikor çözeltisi başına bir mililitre 1.2 mikrogramı, 1.5 mililitrelik bir tüpte 0.2 mililitre nötrofil ortamı ile birleştirin. 384 oyuklu bir plakadaki negatif kontrol kuyucuklarına 25 mikrolitre antikor çözeltisi ekleyin. 15 mililitrelik bir tüpte, dokuz mililitre antikor çözeltisini, 21.6 mikrolitre FMLP çözeltisini ve 1.7784 mililitre nötrofil ortamını birleştirin.
Bu karışımdan 25 mikrolitreyi pozitif kontrole ekleyin ve 384 oyuklu bir plakada kuyucukları test edin. Çok kanallı bir pipet kullanarak, beş mikrolitre bileşik çözeltiyi bileşik kitaplık plakasından 384 oyuklu plakaya aktarın. Süspansiyonu 500G'de bir dakika santrifüjleyin.
16 kanallı bir pipet kullanarak her oyuğa 20 mikrolitre nötrofil süspansiyonu ekleyin. Plakayı bir çalkalayıcı üzerinde 300 RPM'de 10 dakika inkübe edin. Daha sonra hücreleri sabitlemek için, her bir oyuğa üç mikrolitre% 16 paraformaldehit ekleyin ve 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
