Başlamak için, HBSS hücre ayrışma reaktifi EGM-2 ve DMEM'i 10 ila 15 dakika boyunca 37 santigrat derece su banyosuna yerleştirin. Trombin ve laminini gece boyunca 4 santigrat derecede ve fibrinojeni oda sıcaklığında çözdürün. 500 mikrolitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne 1.5 mikrolitre trombin ekleyin.
Mikroakışkanlarda sıkışan havayı çıkarmak için UV ile sterilize edilmiş yüksek verimli plakaları 30 dakika boyunca bir desikatöre yerleştirin. Hücre birleşmesini ve transdüksiyon verimliliğini doğrulamak için T75 şişesini mikroskop altına 4x büyütmede yerleştirin. Hücreleri beş mililitre HBSS ile iki kez yıkayın.
Ardından, şişeye bir mililitre ayrışma reaktifi ekleyin ve bir ila iki dakika boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Avuç içini kullanarak şişeye hafifçe vurun ve mikroskop altında tüm hücrelerin kaldırıldığını gözlemleyin. Hücreleri dokuz mililitre uygun ortamla yıkayın ve süspansiyonu 15 mililitrelik konik bir tüpe toplayın.
Hemen küçük bir alikotu çıkarın ve hücreleri sayın. Hücre süspansiyonunu 300G ve dört santigrat derecede üç ila beş dakika santrifüjleyin. Sonra, süpernatanı çıkarın ve peleti buz üzerinde uygun ortamda yeniden süspanse edin.
Verilen denklemi kullanarak, gereken hücre sayısını hesaplayın. Hücreleri mililitre başına 1 kez 10 ila 6 hücre konsantrasyonunda yeniden süspanse edin ve aşağıdaki denklemi kullanarak gereken hücre hacmini hesaplayın. Gösterildiği gibi gerekli hücre süspansiyonu hacmini santrifüjleyin.
Daha sonra, hesaplanan bir fibrinojen hacminde, peleti buz üzerinde yeniden süspanse edin.
