Başlamak için, hücre kültürü eklerini 24 oyuklu bir doku kültürü adaptör plakasına yerleştirin. Eklerin apikal tarafını enteroid büyüme ortamında 100 mikrolitre bazal membran hücre dışı matris veya BME ile önceden kaplayın. Bariyer bütünlüğü ölçümleri sırasında kontrol olarak kullanmak için ekstra bir ek parça kaplayın.
Ardından, kaplanmış parçayı bir saat boyunca% 5 karbondioksit altında 37 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyon tamamlandıktan sonra, 3D enteroid kültür ortamını aspire edin. Sığır ileal enteroidlerini 1 mililitre buz gibi soğuk yıkama ortamında hasat edin.
Kubbeleri ayırmak ve 15 mililitrelik konik bir tüpte toplamak için bir hücre kazıyıcı kullanın. 1 mililitrelik bir pipet ucuyla, enteroid fragmanları oluşturmak için 30 kez ezin. Daha sonra, enteroid fragmanları parçalamak için yaklaşık 40 kez daha fazla öğütmek için 200 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanın.
Buz gibi soğuk yıkama ortamı ile tüpün hacmini 10 mililitreye kadar tamamlayın. Daha sonra tüpü oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300 g'da santrifüjleyin. BME tabakası da dahil olmak üzere süpernatanı dikkatlice aspire edin.
Daha sonra, her dört kubbe için, peleti 1 mililitre önceden ısıtılmış TrypLE ekspresyon enziminde yeniden süspanse edin. Karışımı 24 oyuklu bir plakaya aktarın ve 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit altında 10 dakika inkübe edin. Enteroidleri daha da parçalamak için karışımı 1 mililitrelik bir pipetle hafifçe pipetleyin.
Ardından, parçaları tek hücrelere ayırmak için karışımı 200 mikrolitrelik bir pipetle pipetleyin. Tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için hücre süspansiyonunu dört kez aspire etmek ve dağıtmak için steril 22 gauge iğne ile donatılmış 3 mililitrelik bir şırınga kullanın. Bir mikroskopla, enteroidlerin% 80'i tek hücrelere ayrılana kadar hücre ayrışmasını izleyin.
Şimdi hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpe toplayın. Reaksiyonu söndürmek için dört hacim FBS yıkama ortamı ekleyin. Daha sonra enteroidleri önceden kaplanmış 40 mikrometrelik bir hücre süzgecinden iki kez 50 mililitrelik konik bir tüpe süzün.
Hücreleri peletlemek için süspansiyonu 300 g'da beş dakika santrifüjleyin. Süpernatanı, ayrışmış sığır ileal enteroid hücre süspansiyonunun santrifüj tüpüne aspire edin. Peletleri az miktarda organoid büyüme ortamında yeniden süspanse edin.
Ardından, hücre canlılığını belirlemek için Tripan Blue boya dışlama yöntemini ve hemasitometreyi kullanın. Hücre kültürü ekindeki fazla kaplama solüsyonunu dikkatlice çıkarın. Tek hücreli süspansiyonun 200 mikrolitresini önceden kaplanmış bir kültür ekinin apikal yüzeyine tohumlayın.
Şimdi ek parçanın bazal yan tarafına 700 mikrolitre FBS komple medya ekleyin. Hücreleri ek parçaya eşit olarak dağıtmak için plakayı sekiz numara şeklinde yaklaşık 10 kez hareket ettirin. Daha sonra plakayı 10 dakika boyunca biyogüvenlik kabinindeki tabak ısıtıcısına yerleştirin.
Plakayı 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit altında 48 saatte inkübe edin. İnkübasyondan sonra, apikal ve bazal bileşenlerdeki ortamı taze enteroid büyüme ortamı ile değiştirin. Ertesi gün, ortamı apikal ve bazal lateral bölmelerden çıkarın.
Ek parçayı PBS ile dikkatlice yıkayın ve sadece inhibitörlerle desteklenmiş enteroid farklılaşma ortamı ile değiştirin. Enterosfer oluşumu, kaplanmış sığır kriptlerinin kültüründen birkaç saat sonra gözlendi. İki gün sonra, kürelerin lümeni iyi tanımlandı ve dördüncü günde tomurcuklanan yapılar gözlendi.
Olgun enteroidler yedinci günde gözlendi. Yedi günlük 3D enteroidlerin immün boyaması, farklı hücre soylarının varlığını gösterdi. E-kaderin proteini aderans kavşağında lokalize edildi.
Enteroidler, enteroendokrin hücreler ve lizozim üreten Paneth hücreleri için pozitifti. Bir haftadan daha kısa bir kültürde birleşik 2D tek tabakalar gözlendi.
