Başlamak için, altı oyuklu bir plakada, bir mililitre insan embriyonik böbrek 293T hücresi tohumlayın. İki mililitre tam DMEM ekleyin. Ertesi gün, hücreleri transfeksiyona hazırlamak için ortamı taze antibiyotik içermeyen ortamla değiştirin.
Yapışık hücreleri transfekte etmek için önce 100 mikrolitre Opti-MEM'e plazmit DNA ekleyerek A karışımını hazırlayın. Ardından, 100 mikrolitre Opti-MEM'e 17,5 mikrolitre polietilenimin ekleyin. Karışım A ve B'nin içeriğini karıştırın, ardından inkübe edin.
İnkübasyon sırasında, karıştırmayı arttırmak için tüpü her üç ila dört dakikada bir hafifçe vurun. Karışımın tüm hacmini HEK 293T hücreleri ile tabağa ekleyin. 16 ila 20 saatlik transfeksiyondan sonra, kültür ortamını taze tam DMEM ile değiştirin.
Psödotip virüsleri üretmek için plakayı 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit altında inkübe edin. 72 saatlik transfeksiyondan sonra, süpernatanı bir toplama tüpüne hasat edin. Süpernatanı oda sıcaklığında yedi dakika boyunca 1.600 G'de santrifüjleyin.
Ardından süpernatanı 0.45 mikrometrelik bir selüloz asetat filtresinden süzün. 96 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına 50 mikrolitre tam DMEM dağıtın. A satırını boş bırakın.
A sırasındaki kuyucuklara 100 mikrolitre psödovirüs stoğu ekleyin.Ardından, 50 mikrolitre çözeltiyi A satırından B satırına pipetleyin.Seri seyreltmeler elde etmek için bu işlemi G satırına kadar tekrarlayın. Tükenmiş ortamı, kültürlenmiş duyarlı HEK 293T ACE2 hücreleri içeren bir plakadan çıkarın ve hücreleri dört mililitre DPBS ile yıkayın. Daha sonra hücreleri DPBS salin içinde bir mililitre tripsin EDTA ile ayırın.
Şimdi, psödotip virüsleri içeren her bir oyuğa 50 mikrolitre duyarlı hücre süspansiyonu ekleyin. Plakayı 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit altında 48 saat inkübe edin. Her oyuğa 100 mikrolitre lusiferaz reaktifi ekleyin.
İnkübasyondan sonra, her bir oyuğun içeriğini 96 oyuklu siyah bir plakaya aktarın. Ardından plakayı bir plaka okuyucuda okuyun. 96 oyuklu bir plakada, B'den H'ye kadar olan sütunlara 10'dan 10'a kadar olan sütunlara 50 mikrolitre taze tam DMEM ekleyin.A satırının karşılık gelen kuyucuklarına 95 mikrolitre taze tam DMEM ekleyin.Şimdi sütun 11'deki kuyucuklara 50 mikrolitre tam DMEM ve sütun 12'ye 100 mikrolitre DMEM ekleyin.
Çok kanallı bir pipet ile ilk sıradaki örnekleri karıştırın ve 50 mikrolitre orta içeren serumu A satırından B satırına H satırına aktarın. Plakayı bir saat boyunca% 5 karbondioksit altında 37 santigrat derecede inkübe edin. Beş mililitrede duyarlı HEK293T ACE2 hücrelerinin bir süspansiyonunu hazırlayın.
Her oyuğa 50 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin, ardından lusiferaz tahlilini gerçekleştirmeden önce inkübe edin. Daha düşük serum seyreltmesi, hücrelere viral girişin azalmasına neden oldu. Bu, artan nötralizasyon yüzdesi ile doğrulanır.
