Proteolitik histon peptitlerini analiz etmek için bir LC-TIMS ToF MS/MS yöntemi geliştirmek için, bir C-18 kolonu ile donatılmış bir HPLC'yi, tescilli pasif teknolojiye sahip ticari bir TIMS ToF MS cihazıyla birleştirin. Ardından, nanoelektrosprey iyonizasyon çalışma koşullarını 4, 500 volt kılcal voltaj, 800 volt uç plaka ofseti, üç bar nebulizatör basıncı, dakikada 10 litre kuru gaz ve 200 santigrat derece kuru ısıtıcıya ayarlayın. MS ayarlarını altı elektron volt çarpışma enerjisi, 1200 VPP çarpışma RF, 75 mikrosaniye aktarım süresi ve beş mikrosaniye ön darbe depolama olarak yapılandırın.
Enjeksiyon hacmini, numunenin sekiz mikrogramına karşılık gelen 20 mikrolitreye ayarlayın ve akış hızını dakikada 0,4 mililitreye ayarlayın. Belirtilen gradyan zaman çizelgesini ve asetonid denemesini %0.1 formik asit yüzdeleriyle girdikten sonra, yöntemi kaydetmek için her iki açılır kutuda da tamam'ı seçin. Her ikisi de %0,1 formik asit içeren su ve asetonitril kullanarak 60 dakikalık doğrusal olmayan bir LC gradyanı çalıştırın.
Pozitif iyonizasyon modunda nanoelektrosprey iyonizasyonu yoluyla HPLC'den TIMS ToF'ye numune elüsyonunu doğrulayın. MS-Digest aracı altında peptit dizilerini ve modifikasyon bölgelerini tanımlamak için, Protein Prospector kullanarak teorik bir peptit listesi oluşturun. Ardından, sindirim koşullarını, translasyon sonrası modifikasyonların türünü, peptit boyut aralığını, kütle algılama aralığını ve kaçırılan bölünmelerin potansiyel sayısını göz önünde bulundurarak teorik bir özet gerçekleştirin.
Elde edilen verileri analiz etmek için, her teorik peptit için artı bir ila artı dört arasında değişen çeşitli şarj durumlarında kütleleri arayın. Her bir kütle / yük oranını belirledikten sonra, tepe noktasını seçin ve peptit dizisine dayalı teorik bir parçalanma iyonları listesi kullanarak MSMS'yi onaylayın. Çeviri sonrası değişiklikler dahil.
Peptitlerin parçalanma spektrumları, farklı pozisyonlarda propiyonil ve asetil grupları dahil olmak üzere çeşitli transkripsiyon sonrası modifikasyonlara sahip üç farklı peptit varyantı ortaya çıkardı. Propiyonillenmiş histon H3 standardı, değiştirilmemiş versiyondan daha uzun peptitler sergiledi. HeLa S3 hücrelerinden ekstrakte edilen histonlar, aynı amino asit pozisyonlarında çoklu translasyon sonrası modifikasyon paternleri gösterdi.
