Başlamak için, 3.75 mililitre indirgenmiş serum ortamını A etiketli bir tüpe pipetleyin ve ortamı 105 mikrolitre transfeksiyon reaktifi ile seyreltin. İyice karıştırmak için tüpün içeriğini girdaplayın. Daha sonra, 3.75 mililitre indirgenmiş serum ortamını B etiketli bir tüpe ekleyin.İfade plazmitlerini 90 mikrolitre arttırıcı reaktif ile seyreltin.
Şimdi A tüpünün içeriğini B tüpüne ekleyin ve inkübasyondan önce iyice karıştırmak için çözeltiyi pipetleyin. Hazırlanmış bir Phoenix eko plakasından 10 mililitre hücre kültürü ortamını dikkatlice çıkarın. Ardından, transfeksiyon karışımının tüm hacmini plakaya damla damla ekleyin.
Hücreleri bir inkübatörde 37 santigrat derecede inkübe edin. MTCM viral hasat ortamını önceden ısıtmak için 37 santigrat derecede bir su banyosuna yerleştirin. Şimdi Phoenix eko plakasını eğin ve kültür ortamını pipetleyin.
Daha sonra, önceden ısıtılmış viral hasat ortamının 30 mililitresini yavaşça eğimli plakaya pipetleyin. Hücreleri inkübatöre geri yerleştirin. 48 saatlik transfeksiyondan sonra, viral süpernatanı hasat edin.
0,45 mikrometre PVDF filtrelerinden süzün. Steril bir şırınganın arkasıyla, izole edilmiş murin dalaklarını 70 ila 100 mikrometrelik bir hücre süzgecinden 50 mililitrelik konik bir tüpe ezin. Ardından süzgeci beş mililitre T hücresi izolasyon tamponu ile yıkayın.
Hücrelerin son hacmini 50 mililitreye getirdikten sonra, hemositometre ile hücreleri sayın. Hücreleri dört santigrat derecede veya oda sıcaklığında 450 G'de 10 dakika santrifüjleyerek peletleyin. Splenositleri içeren hücre peletini önerilen T hücresi izolasyon kiti ile yeniden süspanse edin.
Daha sonra negatif seçim kullanarak CD3 pozitif T hücrelerini izole edin. Manyetik olarak ayrılmış izolatı 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Hücre sayımını tekrar kontrol edin.
İzole edilmiş T hücrelerini dört santigrat derecede 450 G'de 10 dakika santrifüjleyin. Daha sonra hücre peletini MTCM aktivasyon ortamında yeniden süspanse edin. Şimdi T hücrelerini aktive etmek için hücre süspansiyonuna antikor kaplı manyetik boncuklar ve interlökin-2 ekleyin.
Hücreleri gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Sıfırıncı günde, 0.5 mililitre insan fibronektin transdüksiyon arttırıcı reaktifi ile işlenmemiş steril 24 oyuklu plakaları önceden kaplayın. Plakaları gece boyunca dört santigrat derecede saklayın.
Ertesi gün, transdüksiyon reaktifini kuyulardan çıkarın. Kuyucukları oda sıcaklığında 30 dakika boyunca eşit hacimde steril filtrelenmiş BSA takviyeli PBS ile bloke edin. İnkübasyondan sonra, BSA PBS'yi çıkarın ve kuyucukları 0,5 ila bir mililitre PBS ile yıkayın.
Daha sonra, önceden kaplanmış her kuyucuğa bir mililitre saf retrovirüs ekleyin. Plakayı 32 santigrat derecede 90 dakika boyunca 2.000 G'de santrifüjleyin. Daha sonra viral olarak yüklenen her kuyuya bir mililitre aktive edilmiş T hücresi ekleyin.
Plakaları tekrar 450 G'de 32 santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Plakayı gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Beşinci günde, aktive edilmiş T hücrelerini antikor kaplı boncuklardan ayırmak için hücreleri yeniden süspanse edin.
Hücre süspansiyonunu 30 saniye boyunca bir mıknatısın üzerine yerleştirin. Daha sonra süspansiyonu bir ex vivo kültür kabına aktarın. Akış sitometrik analizinden önce kapları 37 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin.
T hücresi izolasyon kitinin kullanımı, transdüksiyondan önce% 98'den daha az T hücresi saflığı verdi. %65 ila 75 arasında tekrarlanabilir CAR ekspresyon oranları elde edildi. İnterlökinler-7 ve 15 ile yapılan ex vivo kültürler, tek bir dalaktan aktivasyon sonrası 10. günde 15 kata yol açtı.
T hücrelerinin interlökinlerle kültürü, karşılaştırılabilir CD8 pozitif ve CD4 pozitif T hücresi frekanslarına yol açtı. 10 günlük ex vivo kültürden sonra, kök hücre hafıza popülasyonlarının korunduğu gözlendi.
