Başlamak için, steril 50 mililitrelik konik bir tüpe sekiz mililitre DPBS ekleyin. Buna sekiz mililitre kan ekleyin ve içeriği iyice karıştırmak için üç mililitre plastik Pasteur pipeti kullanın. Başka bir konik tüpe 15 mililitre lenfosit izolasyon ortamı ekleyin.
Tüpü 20 ila 30 derece eğin. Ardından, kan DPBS karışımının ilk katmanını izolasyon ortamının üzerine nazikçe uygulamak için üç mililitrelik bir Pasteur pipeti kullanın. Kalan karışımı tüpün yan duvarına dikkatlice yerleştirin.
Kalan kanı kan tabakasına katmanlamak için tüpü yavaşça dik konuma getirin. Tüpü 1000G'de oda sıcaklığında 10 dakika boyunca frenler kapalıyken sallanan bir kovada santrifüjleyin. Kan PBMC karışımı dört farklı katmana ayrılacaktır.
Bir Pasteur pipeti ile plazma tabakasının üçte ikisini çıkarın, ardından PBMC'leri toplamak için bir mililitrelik pipet kullanın. Tüm tabaka hasat edilene kadar PBMC'leri 50 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. Ardından, artık izolasyon ortamını ve diğer kalıntıları gidermek için DPBS ile hacmi 25 mililitreye kadar çıkarın.
Tüpü frenler açıkken oda sıcaklığında 100 dakika boyunca 100G'de santrifüjleyin. Ardından süpernatanı bir vakum pompasıyla çıkarın. Daha sonra, peleti bir mililitre DPBS'de yeniden süspanse edin ve peleti yıkamak ve yeniden süspanse etmek için hacmi 25 mililitreye çıkarmak için daha fazla DPBS ekleyin.
Dondurucu bir kabı dört santigrat dereceye soğutun. Sonra fetal sığır serumunu buzun üzerine yerleştirin. İzole edilmiş PBMC'leri içeren hücre peletini bir mililitre fetal sığır serumu içinde yeniden süspanse edin.
Daha sonra, buz üzerinde soğutulmuş serum ile DMSO'yu bir ila beş oranında karıştırın. Hücre süspansiyonunu, toplama tüpü başına bir tüp kullanarak iki mililitre etiketli kriyotüpe aktarın. Otomatik bir hücre sayacı ile hücre sayısını ve canlılığını belirleyin.
DMSOFBS karışımının bir mililitresini tüpe damlatmak için bir mililitrelik bir pipet kullanın. Ardından tüpleri önceden soğutulmuş dondurma kabına yerleştirin. Kabı 24 saat boyunca eksi 80 santigrat derecede bir dondurucuya koyun.
Ertesi gün, tüpleri dondurucudan çıkarın ve sıvı nitrojenin gaz fazında saklayın. Hücre sayıları ve canlılığı, kriyo-korumadan önce ve sonra tutarlıydı, bu da başarılı izolasyon ve korumayı gösteriyordu.
