Başlamak için, ötenazi yapılmış bir farenin disseke edilmiş submandibular tükürük bezinden herhangi bir yağ ve bağ dokusunu çıkarmak için forseps kullanın. Daha sonra bezi buz gibi soğuk HBSS çözeltisi içeren bir toplama tüpüne yerleştirin. Daha sonra, bezi bir santimetre kare parçalara kesmek için forseps kullanın.
% 4 agarozu 50 santigrat dereceye ısıtın ve çözeltiyi 35 milimetrelik bir kaba dökün. Az miktarda agaroz çözeltisini ayrı bir kaba dökün ve bez parçalarını içine ekleyin. Daha sonra parçaları kaplamak için fazla agarozda döndürün.
Daha sonra, agarozlu ilk tabağa dört ila altı parça bez yerleştirin. Kapağı tabağın üzerine yerleştirin ve bir buz kutusuna aktarın, plakayı soğuması ve sertleşmesi için buzla kaplayın. Bez parçalarını bölümlere ayırmak için, önce bez gömülü agaroz bloğunun etrafını dikkatlice kesmek için bir neşter kullanın.
Ardından, agaroz bloğuna bir damla süper yapıştırıcı uygulayın ve bir vibratom aşamasına yapıştırın. Şimdi vibratom odasını% 1 penisilin streptomisin içeren buz gibi PBS ile doldurun. Bir neşter ile fazla agarozu kesin ve her bir bez parçası arasında beş milimetre boşluk oluşturun.
Vibratom bıçağını agaroz bloğu ile hizalayın ve bölümlerin başlangıç ve bitiş noktalarını ayarlayın. Doku bloğunu düşük hızda ve yüksek titreşimde 150 mikrometre kalınlığında bölümler halinde kesin. Bölümler kesildikten sonra, dilimleri almak için bir boya fırçası kullanın ve bunları antibiyotik içeren önceden ısıtılmış RPMI ortamı olan bir tabağa yerleştirin.
Submandibular dilimleri kültürlemek için, önce altı oyuklu bir plakanın kuyucuklarına 1.5 mililitre RPMI ortamı ekleyin. Kuyucuklara 0,4 mikrometre filtre yerleştirin. Daha sonra, bir boya fırçası yardımıyla, her filtreye bir ila altı dilimi dikkatlice aktarın.
Daha sonra plakayı 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit altında inkübe edin. Yaralanmaya neden olmak için bazı deney plakalarını gama radyasyonu ile ışınladıktan sonra, plakaları inkübatöre geri koyun. Daha sonra, 24 oyuklu bir plakanın kuyularını 500 mikrolitre kültür ortamı ile doldurun.
Bir boya fırçası ile dilimleri filtreden kaldırın ve yavaşça kuyucuklara daldırın. Dilimleri ilgili nükleer lekelerde inkübe edin. Daha sonra dilimleri hafif çalkalama altında 37 santigrat derecede iki saat boyunca antikorlarla inkübe edin.
Dilimleri yıkamak için üç kez kültür ortamına batırın. Dilimlerin her bir yıkama solüsyonunda oda sıcaklığında hafif çalkalama altında 10 dakika inkübe edilmesine izin verin. Ardından, bandı çift taraflı bir görüntüleme ara parçasından çıkarmak için forseps kullanın.
Ara parçayı cam tabanlı altı kuyulu bir plakanın altına yapıştırın, ardından ara parçanın ortasındaki boşluğa 50 mikrolitre ortam pipetleyin. Dilimi düz durduğundan emin olarak ortama yerleştirin. Ardından bir pipetle, 20 mikrolitre ortamı boşluktan dikkatlice çıkarın.
Bandı ara parçanın üst tarafından dikkatlice çıkarmak için forseps kullanın ve üzerine 25 milimetrelik dairesel bir kapak kayması yerleştirin. Kapak kaymasının sıkıca yapışmasını sağlamak için ara kenarların etrafına bastırın. Dilimi konfokal mikroskopta görüntüleyin.
Yedi gün boyunca kültürlenen submandibular bezin ışınlanmamış dilimleri MT sinyallerini ve epitel mimarisini korudu. Bununla birlikte, ışınlamadan üç gün sonra, asiner ve duktal hücre atrofisi gözlendi. Kaspaz pozitif hücreler ışınlamadan dört gün sonra görüldü.
Işınlanmış dilimlerde yüksek gama H2AX gözlendi, bu da in vivo DNA hasarının göstergesidir. Makrofajların gerçek zamanlı görüntülemesi, dilim kültür modelinde epitel hücrelerinin fagositozunu doğruladı. Tek tek hücreler, göç gibi hücre davranışının sonraki analizi için tespit edilebilir ve bölümlere ayrılabilir.
