CDNA Library Preparation from the Drug Treated-Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) Lysate for mRNA Sequencing

Başlamak için, ilaçla tedavi edilen PBMC'leri santrifüjleme yoluyla hasat edin ve hücre lizatını bir PCR plakasında toplayın. Alttaki lizatı toplamak için plakayı santrifüjleyin. Ardından, bir termocycler kullanarak mRNA denatürasyonu gerçekleştirin.

Daha sonra, toplam 12 mikrolitrelik bir hacim elde etmek için her bir oyuğa altı mikrolitre ters transkriptaz reaksiyon karışımı ekleyin. Kirlenmeye karşı korumak ve buharlaşmayı önlemek için plakayı kapatın. Plakayı kısa bir süre girdapladıktan sonra santrifüjleyin.

Plakayı termosikleyici üzerine yerleştirin ve ters transkripsiyon reaksiyon programını başlatın. Ters transkripsiyondan sonra, PCR plakasını santrifüjleyin, her bir kuyucuğa 15 mikrolitre ön amplifikasyon karışımı ekleyin ve kapatın. Kapalı plakayı termodöngüleyiciye yerleştirin ve ön amplifikasyon reaksiyonunu başlatın.

CTNA'yı temizlemek için, her bir oyuğa manyetik saflaştırma boncukları ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. PCR plakasını beş dakika boyunca veya boncuklar ayrılana kadar manyetik bir rafa yerleştirin. Bundan sonra, süpernatanı dikkatlice çıkarın.

Plakayı manyetik rafta tutarken, boncukları temizlemek için 100 mikrolitre taze hazırlanmış% 80 etanolü nazikçe ekleyin. 30 saniyelik bir inkübasyondan sonra, süpernatanı ortadan kaldırmak için bir pipet kullanın. Boncukların manyetik rafta beş dakika boyunca veya etanol tamamen buharlaşana ve boncuklar artık parlak görünmeyene kadar kurumasını bekleyin.

Plakayı manyetik raftan çıkardıktan sonra, boncukları 20 mikrolitre nükleaz içermeyen suda tekrar süspanse edin. Boncuklar ayrılana kadar plakayı manyetik rafa yeniden konumlandırın. Elüiti, cDNA kalite kontrolü ve etiketleme için hazırlanmış yeni bir PCR plakasına aktarın.

Etiketleme için, her reaksiyon için yeni bir PCR plakasına üç mikrolitre etiketleme karışımı ekleyin. Her reaksiyona bir mikrolitre cDNA ekleyin. Etiketleme reaksiyonunu hemen başlatın.

Daha sonra her reaksiyona bir mikrolitre nötralize edilmiş etiketleme tamponu ekleyerek reaksiyonu nötralize edin. Zenginleştirme PCR için, toplam 14 mikrolitre hacim elde etmek için her reaksiyona dokuz mikrolitre zenginleştirme PCR karışımı ekleyin. Zenginleştirme PCR programını başlatın.