Hücre geçişinden önce. altı oyuklu bir plakayı soğuk kaplama çözeltisi ile kaplayın ve bir saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin, kök hücre ortamını insan pluripotent kök hücrelerini içeren altı oyuklu plakadan aspire edin ve her bir kuyucuğa bir mililitre kalsiyum magnezyum içermeyen DPBS ekleyin. İkinci yıkamadan sonra, her bir kuyucuğa 500 mikrolitre ayrışma çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında iki ila beş dakika inkübe edin.
Bu arada, kaplama çözeltisini altı oyuklu plakadan aspire edin ve her oyuğa bir mililitre kalsiyum magnezyum içermeyen DPBS ekleyin. Ters çevrilmiş bir mikroskop altında, hücre ayrışma sürecini gözlemleyin. Hücrelerin% 80 ila 90'ı yuvarlak ve yapışkan göründüğünde, ayrışma çözeltisini altı oyuklu plakanın oyuklarından aspire edin.
Daha sonra altı oyuklu plakaya 10 mikromolar kaya inhibitörü içeren bir mililitre kök hücre ortamı ekleyin. Bir tüpe 10 mikrolitre ayrışmış hücre süspansiyonu ekleyin. Ardından, eşit hacimde tripan mavisi ekleyin.
Yavaşça karıştırın ve bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Hücre sayımından sonra, 0.8 ila 1 kez 10 ila 6 içeren kuyucuk başına iki mililitre kök hücre ortamı ekleyin.th mililitre başına hücreler ve 10 mikromolar kaya inhibitörü. Plakayı üç kez hızlı bir şekilde ileri geri, yan yana hareket ettirin.
Plakayı 37 santigrat derece,% 5 karbondioksit inkübatörüne yerleştirin. İki saat inkübe etmeden önce plakayı 10 kez hızlı bir şekilde ileri geri ve yan yana hareket ettirin. Hem sıfır hem de dördüncü günler için bazal ortamı çözün ve buz üzerinde takviye edin.
Her gün iki mililitre, bir orta ve bir yıkama ortamı, biri 37 santigrat derece su banyosunda beş dakika ısıtın. Daha sonra, kök hücre ortamını altı oyuklu bir plakanın kuyularından aspire edin ve iki mililitre yıkama ortamı ekleyin. Birinci yıkama ortamını aspire ettikten sonra, hemen kuyu kenarına iki mililitre birinci gün ortamı ekleyin.
Hücreleri 24 saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Farklılaşma işleminin 12. gününde, 400 mikrometre mikro kuyu içeren altı oyuklu bir plakaya iki mililitre Yapışma Önleyici Durulama Solüsyonu uygulayın. Ters çevrilmiş bir mikroskop altında, plakada kabarcıklar olup olmadığını gözlemleyin.
Kabarcık gözlenmezse, Yapışma Önleyici Durulama Solüsyonunu aspire edin ve hemen iki mililitre yıkama ortamı ekleyin. Daha sonra, pankreas progenitör ortamını aspire edin ve oyuk başına 0.5 mililitre ayrışma tamponu ekleyin. Hücreleri oda sıcaklığında iki ila beş dakika inkübe edin.
Hücrelerin çoğu yuvarlatıldığında ve hala yapıştığında, ayrışma tamponunu aspire edin ve hemen her oyuğa bir mililitre sıcak küme ortamı ekleyin. Bir P1000 pipet ucu kullanarak, hücreleri nazikçe ayırın, dönüşümlü olarak dairesel bir hareket kullanarak yukarı ve aşağı pipetleyin ve hücreleri kuyu boyunca eşit şekilde ayırmak için kuyunun üstünden altına doğru hareket edin. Ayrışmış hücre karışımını 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.
Kalan tüm hücreleri toplamak için altı oyuklu plakaya bir mililitre küme ortamı ekleyin. Daha sonra, mikrokuyu altı oyuklu plakadan yıkama ortamı ikisini aspire edin ve ayrışmış hücre süspansiyonu ekleyin. Hücreleri 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Ertesi gün, bir P1000 pipet ucu kullanarak, mikro kuyu altı oyuklu plakadan kümeleri yavaşça 50 mililitrelik bir konik tüpe toplayın. Kalan kümeleri toplamak ve kümeleri tüpe aktarmak için bir mililitre 13. gün ortamı ekleyin. Hücrelerin yerçekimi altında doğal olarak beş dakika boyunca tüpün dibine yerleşmesine izin verin.
Hücre kümelerini bozmadan süpernatanı tüpten dikkatlice aspire edin. Ardından, tüpe iki mililitre 13. gün ortamı ekleyin. Kümelerin aspirasyonunu önleyerek yukarı ve aşağı pipetleyerek nazikçe karıştırın.
Süspansiyonu çok düşük yapışan altı oyuklu bir plakaya aktarın. Plakayı altı kez hızlı bir şekilde ileri geri, yan yana hareket ettirin. Hücreleri 48 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Kümelerin immünofloresan görüntüleri, pankreas beta hücre belirteçlerini birlikte eksprese eden insülin üreten hücrelerin baskınlığını gösterdi. Beta hücre imza genlerinin ekspresyonu, Nkx6.1 eksprese eden hücrelerin yaklaşık% 25'ini ve% 40'ı Pdx1'i eksprese etti. Glikoz ile uyarılan insülin sekresyon testi sırasında, MEL1'den türetilen kümeler, düşük glikoz konsantrasyonlarına kıyasla yüksek glikoz konsantrasyonlarına yanıt olarak önemli ölçüde daha yüksek seviyelerde insülin salgıladı.
