Başlamak için, izole edilmiş kan plazma örneklerini 37 santigrat derecede çözün. Her plazma örneğinin 100 mikrolitresini 1.5 mililitrelik tüplere aktarın. Her tüpe bir mililitre kalsiyumsuz HBSA tamponu ekleyin.
Numuneleri 20.000 g'da dört santigrat derecede 15 dakika santrifüjleyin. Peletleri bozmadan süpernatanı 20 mikrolitreye aspire edin. Daha sonra, her tüpe bir mililitre kalsiyum içermeyen HBSA tamponu ekleyin.
Ardından peleti sulandırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin. Hücre dışı veziküllerin eşit dağılımını sağlamak için her tüpü birkaç saniye vorteksleyin. Daha sonra dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 20.000 g'da santrifüjleyin.
Yine, peleti bozmadan süpernatanı 20 mikrolitreye aspire edin. Daha sonra peleti 80 mikrolitre kalsiyum içermeyen HBSA tamponunda sulandırın. Eşit bir süspansiyon elde etmek için süspansiyonu yukarı ve aşağı pipetleyin.
Hücre dışı vezikül doku faktörü aktivitesini ölçmek için, önce hücre dışı vezikül örneğinin 40 mikrolitresini 96 oyuklu bir plakanın iki oyuğuna pipetleyin. İlk kuyucuğa, 11 mikrolitre inhibitör fare anti-insan TF IgG ekleyin. Diğer kuyucuğa, 11 mikrolitre kontrol faresi IgG ekleyin.
İnkübasyondan sonra, her bir oyuğa 50 mikrolitre faktör karışım çözeltisi ekleyin. Plakayı filmle örtün, ardından plakayı 37 santigrat derecede iki saat inkübe edin. Faktör Xa oluşumunu durdurmak için 25 mikrolitre HBSA EDTA tamponu ekleyin.
Kromojenik substratı damıtılmış suda dört milimol konsantrasyonuna kadar sulandırın. Şimdi her bir oyuğa 25 mikrolitre kromojenik substrat ekleyin. Plakayı filmle örtün ve ardından alüminyum folyoya sarın.
Plakayı 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Daha sonra, kabarcıkları gidermek için plakayı bir dakika boyunca 1.500 g'da santrifüjleyin. Ardından plakayı 405 nanometrede bir plaka okuyucuya yerleştirin.
Her bir kuyucuğun faktör Xa oluşumunu dönüştürmek için relipidlenmiş rekombinant doku faktörü ile oluşturulan standart eğriyi kullanın. Daha sonra doku faktörüne bağlı faktör Xa oluşumunu hesaplayın. 11 donörden altısı orta ila yüksek lipopolisakkarit yanıtlayıcıları iken, 11 donörden beşi düşük lipopolisakkarit yanıtlayıcılarıydı.
