Başlamak için, 200 mikrolitre hacimde 10.000 hepatoselüler karsinom hücresini DMEM ve% 10 FBS ile 96 oyuklu bir plakaya tohumlayın. Hücreleri gece boyunca 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir inkübatörde% 5 karbondioksit altında inkübe edin. Ertesi gün, kültür ortamını değiştirin ve hücrelere değişen konsantrasyonlarda hidrojen peroksit ve menadion uygulayın.
Beş miligram DHE'yi bir mililitre DMSO'da çözün. Çalışma çözeltisi için, 100 mikromollük bir alikotu önceden ısıtılmış DMEM ortamı ile 10 mikromol konsantrasyonuna seyreltin. Düzgün karıştırmayı sağlamak için çalışma boyası çözeltisini 5 ila 10 saniye vorteksleyin.
Şimdi karsinom hücrelerini ayakta tutmadan önce test ortamını her bir kuyudan çıkarın. Ardından her birini PBS ile nazikçe yıkayın. Her bir kuyucuğa 100 mikrolitre çalışma boyası çözeltisi pipetleyin.
Plakayı 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. DHE içeren ortamı her kuyucuktan çıkarın. PBS ile her kuyuyu üç kez yıkamak için çok kanallı bir pipet kullanın.
Şimdi, her bir oyuğa Hoechst 33342 nükleer boyama boyası içeren 200 mikrolitre PBS pipetleyin. İnkübasyondan sonra, plakayı yüksek içerikli bir tarama platformuna aktarın. Cellomics CX7 yüksek içerikli tarama yazılımını başlatın.
Görüntüleme platformunu üreticinin teknik özelliklerine göre kalibre edin. Cihaz veritabanında plaka markasına özel sistem parametrelerini açın. Ardından, numunelerin bulunduğu plakayı dikkatlice görüntüleme sisteminin ısıtılmış aşamasına yerleştirin.
Plakanın güvenli bir şekilde yerleştirildiğinden ve doğru yönde olduğundan emin olun. Ardından, sahneye düz bir şekilde oturduğundan emin olmak için mikroplakaya hafifçe bastırın. Plaka doğru şekilde yerleştirildikten sonra Kontrol tuşunu basılı tutun.
Ardından Plaka Yükleme/Boşaltma diyalog kutusunu açmak için Kontrol ve Tamam'a tıklayın. Görüntüleme parametrelerini seçmek için, Cellomics BioApplications arayüzünde Hedef Etkinleştirme modunu açın. Nükleer boyama ve DHE floresan probu ile uyumlu çift kanallı veri toplama için yeni bir protokol oluşturun.
Ardından, görüntü elde etmek için gerekli hedefleri belirtin, ardından uygun büyütmeyi seçin. Şimdi pozlama süresini, kamera bükülmesini ve z-yığını aralığını belirtin. Görüntüleme parametreleri ayarlandıktan sonra, cihazdaki farklı algoritmaları kullanarak ilgilenilen birincil izleme nesnesini belirleyin.
Tanımlanan nesneyi bölümlere ayırdıktan sonra, birincil nesneyi her hücre türüne özgü belirli boyut, şekil ve yoğunluk parametrelerine göre doğrulayın. Nesnenin etrafındaki ilgi alanını tanımlayın ve etrafına 20 mikrometrelik bir daire yerleştirin. Popülasyon Karakterizasyonu sekmesine tıklayın, ardından tarama sınırını alan başına en az 10 nesne olacak şekilde kuyu başına 1000 hücre olarak ayarlayın.
Şimdi her bir kuyu plakasını taramak için Görünümü Başlat'a tıklayın. Ardından görünüm analizi yazılımını başlatın ve ek analiz için nicel veri parametrelerini CSV formatında dışa aktarın. Peroksit maruziyeti, doza bağlı bir şekilde tüm hücre hatlarında ROS kaynaklı floresansın istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde artmasına neden oldu.
Menadion ile JHH-4 hücreleri, floresan yoğunluğunda doza bağlı bir artış gösterdi. Bununla birlikte, floresandaki önemli fark, diğer iki hücre hattında sadece daha yüksek konsantrasyonlarda gözlendi.
