Murin aort ve mezenterik arterlerden izole edilen CD34+kök hücreleri karakterize etmek için doku blok kültürü yapılır ve manyetik ayırma ile hücreler elde edilir. Farklılaşmadan sonra fibroblast hücre işaretleyici ekspresyonunda endotel hücresini tespit etmek için, hücreleri 488 nanometrelik lazer uyarımları ile 40x büyütmede gözlemleyin. Hücreleri tripsinledikten sonra, santrifüjleme ile pelet haline getirin ve 100 mikrolitre ayırma tamponunda yeniden süspanse edin.
Daha sonra onları fare karşıtı CD16 / CD32 monoklonal antikorları ile dört santigrat derecede beş dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra immünofloresan boyama için istenen her monoklonal antikorun iki mikrolitresini ekleyin ve 10 dakika boyunca 4 santigrat derecede tekrar inkübe edin. Hücreleri bir mililitre tamponla iki kez yıkayın.
Hücreleri gösterildiği gibi santrifüjledikten sonra, süpernatanı çıkarın ve hücreleri 300 mikrolitre tamponda yeniden süspanse edin. Hücreleri akış tüplerine aktarın ve bir buz kutusuna yerleştirin. Farklılaşmış hücrelerin yüzdesini kontrol etmek için akış sitometrisini çalıştırın.
Flow sitometrik değerlendirme, izole CD34 + vasküler duvar kök hücrelerinin yüksek saflığını doğruladı. Hücresel immünofloresan boyama, izole edilen CD34 + kök hücrelerin ağırlıklı olarak kök hücre belirteçlerini, CD34, c-kit ve Flk-1'i eksprese ettiğini gösterdi. Akış sitometrisi ayrıca izole edilen CD34 + kök hücrelerin in vitro olarak fibroblastların yanı sıra endotel hücrelerine farklılaşma yeteneğine sahip olduğunu doğruladı.
