Başlamak için, deneysel banyo odasına temiz bir cam slayt monte edin. Slaytı iki ila üç mikrolitre laminin ile kaplayın ve 30 saniye kurumasını bekleyin. Daha sonra, yaklaşık 400 mikrolitre kas lifi süspansiyonunu lam üzerine dökün ve liflerin laminine 10 ila 15 dakika yapışmasına izin verin.
Deney odasını, epifloresan için donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskop sahnesine yerleştirin. Liflerin canlılığını doğrulamak için, deney odasının her iki tarafına iki platin elektrot yerleştirin. 0,8 ila 1,2 milisaniye boyunca dikdörtgen akım darbeleri uyguladıktan sonra, uç noktalarda kas lifi kasılmalarını gözlemleyin.
Lifleri, Tyrode çözeltisinde dört ila beş dakika boyunca hızlı kalsiyum boyası Mag-Fluo-4'nin 3,5 ila 4,5 mikromolar ile yükleyin. Slaytı Tyrode çözeltisi ile yıkadıktan sonra, hücre içi boyanın karanlıkta 15 ila 20 dakika esterleşmesine izin verin. Loş aydınlatma altında kalsiyum geçişlerinin alınması sırasında, ışık sinyallerini yağa daldırma 40X objektif ve bir sayısallaştırıcıya bağlı bir fotoçoğaltıcı tüp ile toplayın ve kaydedin.
Edinme yazılımında, sıfırdan 200 rastgele birime kadar bir ölçek sağlayın. Ardından, dinlenme floresansını veya F-restini 10 rastgele birime ayarlamak için uyarma noktasının boyutunu ve fotoçoğaltıcı tüpün kazancını ayarlayın. Kayıtları analiz etmek için, bir kilohertz'de tüm ize bir alçak geçiren filtre ayarlayın.
Ardından, izlemenin bir saniyesinde F-rest'i hesaplamak için tepe noktasını ayarlayın. F-rest'i sıfıra ayarlayın ve tepe sarkoplazmik kalsiyum geçici genliğinin genliğini ölçün. Genliğin %10 ila %90'ı arasında yükselme süresini, yarı maksimumdaki süreyi ve genliğin %90 ila %10'u arasında bozunma süresini ölçün.
Ardından, bozunma kinetiğini iki üstel fonksiyona uygun olarak tahmin edin. Mikromolar cinsinden en yüksek kalsiyum konsantrasyonunu hesaplayın. Son olarak, bozunma tau 1 ve tau 2'nin zaman sabitlerinin ve A1 ve A2 genliklerinin değerlerini kaydedin. FDB ve EDL kasları, morfoloji tip II olarak bilinen kalsiyum kinetiği gösterdi Soleus kasları, morfoloji tip I kalsiyum geçişleri sergiledi.
PDQA, PL ve EHL kaslarından gelen lifler tip II morfolojiyi paylaştı. Kalsiyum geçişinin PDQA, PL ve EHL'nin kinetik sinyalleri, FDB EDL kaslarının sinyallerine benzerdi, ancak soleus kas sinyallerinden farklıydı.
