Kolonilerin öldürücü olmasını sağlamak ve enfeksiyon tahlillerinde öldürücü olmayan kolonilerin kullanılmasını önlemek için Kongo Kırmızısı boyası içeren agar plakaları üzerinde üç çizgili Shigella suşları. Başlamak için, bir gecede yetiştirilen Shigella kültürlerini alın ve onları girdaplayın. Bir kültür tüpünde beş mililitre taze TSB'ye 100 mikrolitre kültür ekleyin.
600 nanometrede 0,7'lik bir optik yoğunluğa ulaşılana kadar 250 RPM'de çalkalarken kültürleri 37 santigrat derecede inkübe edin. 2 kez 10 subkültürlenmiş Shigella'nın 8 koloni oluşturan birimine 2 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Oda sıcaklığında iki dakika boyunca 17.000 g'da santrifüjleme ile pelet hücreleri.
Süpernatanı aspire edin. Bir mililitre ılık PBS ekleyin ve peleti iyice tekrar süspanse edin. Hücreyi bir kez daha santrifüjledikten sonra, peleti iki mililitre ılık DMEM'de yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonunu girdaplayın.
Daha sonra, altı oyuklu plakadaki HT29 kolonik epitelyal tek katmanlarının her bir oyuğuna bir mililitre yeniden süspanse Shigella ve bir mililitre DMEM ekleyin. HT29 hücreleri ile bakteriyel teması sağlamak için, altı kuyucuklu plakayı oda sıcaklığında veya 37 santigrat derecede 10 dakika boyunca 2.000 g'da santrifüjleyin. Altı kuyucuklu plakayı 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte 45 dakika inkübe edin.
Bakteriyel enfeksiyon titresini belirlemek için, PBS'de yeniden süspanse edilmiş Shigella hücrelerinin on kat seri dilüsyonlarını hazırlayın. 100 mikrolitrelik 1 çarpı 10 ila 5 ve 1 çarpı 10 ila 6 seyreltmeyi TSB ile Kongo kırmızı plakalarına yerleştirin ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyondan sonra, her bir kuyucuktan ortamı aspire edin.
Her kuyucuğa bir mililitre ılık PBS ekleyin ve nazikçe yıkayın. Daha sonra mililitre gentamisin başına 50 mikrogram ile iki mililitre ılık DMEM ekleyin ve% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Enfekte olmuş HT29 hücrelerini bir mililitre PBS ile üç kez yıkayın.
Her oyuğa gentamisin içeren iki mililitre ılık DMEM ekleyin ve% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede hücre içi replikasyon için 24 saate kadar inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, hücreleri bir mililitre PBS ile iki kez yıkayın. HT29 hücrelerini parçalamak için her kuyucuğa% 1 Triton X-100 içeren bir mililitre PBS ekleyin.
Daha sonra bir hücre kazıyıcı veya bükülmüş pipet ucu kullanarak, parçalanmış hücreleri kuyu diplerinden kazıyın ve karışımı 1.7 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Shigella'yı parçalanmış ökaryotik hücrelerden daha fazla uzaklaştırmak için her tüpü en az 30 saniye boyunca vorteksleyin. Lizatların ve PBS'nin on kat seri dilüsyonlarını hazırlayın.
Seri seyreltmenin 100 mikrolitresini TSB ile Kongo kırmızı plakalarına yerleştirin ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
