Başlamak için, GUV dış tampon çözeltisini 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde hazırlayın. Spermidin, ATP, GTP, CTP, UTP, kreatin fosfat, magnezyum asetat, potasyum glutamat, HEPES, potasyum hidroksit, folinik asit ile karıştırılır. glikoz ve amino asit stoğu.
Çözeltinin son hacmini bir mililitreye getirmek için ultra saflaştırılmış deiyonize su ekleyin. Daha sonra, bir davlumbazda, 15 mililitrelik bir cam şişeye 17.3 mikrolitre POPC stok çözeltisi ekleyin. Bunun için 1.08 mikrolitre PEO-b-PBD kopolimeri pipetleyin.
Kloroformu buharlaştırmak için şişeyi döndürürken cam şişeye hafif bir argon gazı akışı dikkatlice üfleyin. Daha sonra cam şişeye 1,2 mililitre hafif mineral yağ pipetleyin. Lipid ve yağı 10 ila 20 saniye boyunca maksimum hızda girdaplayın.
Cam şişeyi maksimum hızda 10 ila 20 saniye daha girdaplamadan önce 20 dakika boyunca yaklaşık 50 santigrat derecede bir fırına koyun. Daha sonra, 270 mikrolitre GUV dış solüsyonunu 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin. Bunun için, her biri beş molar sodyum klorür ve 4.5 molar potasyum klorürden oluşan 15 mikrolitre pipetleyin.
GUV dış solüsyonunun üzerine 300 mikrolitre lipid ve yağ karışımını nazikçe pipetleyin. İnkübasyondan sonra, 1 ila 3 Çözeltilerini, çözünür sfGFP'yi kodlayan DNA plazmidini veya glutamat reseptörü sfGFP, murin RNAse ve bir molar sükrozu bir şişeye pipetleyerek bir CFE reaksiyonu birleştirin. Reaksiyon hacmini 20 mikrolitreye çıkarmak için ultra saf deiyonize su ekleyin.
20 mikrolitrelik reaksiyon karışımını içeren mikrosantrifüj tüpüne 600 mikrolitre lipit-yağ karışımı ekleyin. Reaksiyonu emülsifiye etmek için bir dakika boyunca kuvvetlice yukarı ve aşağı pipetleyin. İç emülsiyonu tüpteki yağ tabakasının üzerine nazikçe yerleştirin.
Dört santigrat derecede 2000 g'da 10 dakika santrifüjleyin. Ardından, mikrosantrifüj tüpündeki fazla yağı ve dış çözeltiyi dikkatlice pipetleyin. Yeniden süspanse etmek için GUV peletini kalan çözeltide yavaşça karıştırın.
GUV solüsyonunu inkübasyon için temiz, 96 kuyulu şeffaf düz tabanlı bir plakaya aktarın. Mühürlü plakayı, beş ila altı saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe etmek için bir plaka okuyucuya aktarın. İnkübasyondan sonra, plakayı ters çevrilmiş bir konfokal mikroskop üzerine yerleştirin.
GUV'leri içeren bir ilgi alanına odaklanın, ardından görüntüleri 488 nanometrelik bir uyarma dalga boyunda yakalayın. Görüntüleri TIFF formatında kaydedin. Görüntüleri bir görüntü işleme yazılımında açın.
Açmak için Parlaklık/Kontrast ayar paneline tıklayın. Ardından, floresan proteinleri görünür hale getirmek için parlaklığı ve kontrastı ayarlayın. GUV içinde kapsüllenen vahşi tip glutamat reseptörü hücresiz ekspresyon reaksiyonları, mükemmel ekspresyon ve membran lokalizasyonu gösterdi.
PRSP-glutamat reseptörü agregasyona ve punktat oluşumuna eğilimliydi. Çözünür sfGFP, GUVS cinsinden eksprese edildi ve GUV lümeninde kaldı.
