Başlamak için iki mililitrelik mikro santrifüj tüpünü etiketleyin. 50 mikrolitrelik E.coli DnaK756 kültürlerini tüplere pipetleyin. Tüpleri buzun üzerine yerleştirin.
E.coli alikotları ile her ayrı tüpe 10 ila 50 nanogram plazmit DNA ekleyin. Tüpleri 30 dakika buz üzerinde tutun. Ardından, hücreleri ısı şoku vermek için hücreleri 60 saniye boyunca 42 santigrat dereceye yerleştirin.
Tüpleri 10 dakika buza geri koyun. Tüplere 950 mikrolitre taze iki kez maya tripton suyu pipetleyin, ardından tüpleri 37 santigrat derecede bir çalkalayıcıda inkübe edin. Dönüştürülmüş hücre kültüründen 100 mikrolitre pipetleyin ve bunları iki kez maya tripon içeren antibiyotik içeren agar plakalarına yayın.
Hücrelerin geri kalanını dört santigrat derecede 5.000 G'de bir dakika santrifüjleyin. Et suyunun yaklaşık 800 mikrolitresini boşaltın. Kalan ortamda peletlenmiş hücreleri yeniden süspanse edin.
Geri kazanılan hücreleri iki kez maya tripton agar plakasına yerleştirin, ardından her iki agar plakasını gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Hücreleri kaplamak için, dönüştürücülerden tek bir koloniyi almak için steril bir halka kullanın. Antibiyotiklerle desteklenmiş 10 mililitre iki kez maya tripton suyuna aşılayın.
Şimdi, iki mililitrelik mikro santrifüj tüplerinde hücrelerin 100'den 10'a kadar negatif beşte birine kadar seri dilüsyonlarını hazırlayın. Hücreleri tespit etmeden önce, antibiyotik ve IPTG ile desteklenmiş agar plakalarını, kapakları kısmen açık olarak 40 santigrat derecede bir fırına koyun. Plakalar yeterince kuruduktan sonra, seri olarak seyreltilmiş hücrelerin iki mikrolitresini agar plakalarına yerleştirin.
Her numuneyi iki ayrı plakaya yerleştirin. Bir tabağı 37 santigrat derece izin verilen büyüme sıcaklığında ve diğerini 43.5 santigrat derece izin verilmeyen büyüme sıcaklığında inkübe edin. Rekombinant proteinlerin ekspresyonunu doğrulamak için, kalan hücrelerin bir kısmını aynı transformant kolonisinden almak için steril bir halka kullanın.
Hücreleri 10 mililitre antibiyotik takviyeli maya tripton suyuna aşılayın. Kültürleri gece boyunca 37 santigrat derecede bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin. Tüm E.coli DnaK756 hücreleri, 37 santigrat derecenin izin verilen büyüme sıcaklığında büyüdü.
Bununla birlikte, sadece DnaK ve KPf eksprese eden heterolog hücreler, izin verilmeyen büyüme sıcaklığında büyüdü. KPf-V436F'yi eksprese eden mutant hücreler sadece 37 santigrat derecede büyüdü, ancak 43.5 santigrat derecede büyüyemedi.
