Çalışma, Uluslararası Genetik Mühendisliği ve Biyoteknoloji Merkezi (ICGEB) hibe numarası, HDI/CRP/012, Venda Üniversitesi Araştırma Direktörlüğü, hibe I595, Bilim ve Yenilik Bölümü (DSI) ve Güney Afrika Ulusal Araştırma Vakfı'ndan (NRF) (hibe numaraları, 75464 ve 92598) elde edilen hibe fonu ile desteklenmiştir.

1. Dönüşüm
NOT: Kültür, pipet uçları ve yeni hazırlanmış ve otoklavlanmış ortamlar için steril cam eşyalar kullanın. 2x maya triptonunda (YT) [% 1.6 tripton (a / v),% 1.6 maya özütü (a/v),% 0.5 NaCl (a / v),% 1.5 agar (a / v)] agarda E. coli hücrelerinin kültürlerini hazırlayın. Protokolde kullanılan genel reaktifler ve kaynakları Malzeme Tablosunda verilmiştir.
<ol><li>2.0 mL mikrosantrifüj tüplerini etiketleyin ve hücreleri buz üzerinde tutarak 50 μL yetkin E. coli dnaK756hücrelerini ayırın.</li>
	<li>Yetkin hücrelere sahip 2.0 mL'lik mikrosantrifüj tüplerine, 10-50 ng pQE60 / DnaK, pQE60 / KPf ve pQE60 / KPf-V436F plazmit DNA9'u ayrı tüplere ayırın.</li>
	<li>Yetkili hücreleri ve plazmit DNA'yı içeren 2.0 mL'lik mikrosantrifüj tüplerini 30 dakika buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Yetkili hücreler-DNA karışımını 42 ° C'de 60 saniye boyunca ısı şoku yapın ve mikrosantrifüj tüplerini 10 dakika boyunca tekrar buza geri döndürün.</li>
	<li>950 μL taze 2x YT et suyu (37 °C'de önceden inkübe edilmiş) ekleyin ve 1 saat boyunca 150 devir/dk'da çalkalarken 37 °C'de inkübe edin. Gerekirse iyileşmelerini teşvik etmek için hücreleri çok daha uzun süre büyümeye bırakın. NOT: Hücreleri kuvvetlice sallamaktan kaçının.</li>
	<li>Hücrelerin 100 μL'sini pipetleyin ve bunları ilgili suş için 50 μg/mL kanamisin, 10 μg/mL tetrasiklin ve plazmit seçimi için 100 μg/mL ampisilin içeren 2x YT agar plakalarına yayın (bkz.</li>
	<li>Hücrelerin geri kalanını (hacmi şu anda yaklaşık 900 μL olan) bir tezgah üstü mikrosantrifüj kullanarak 5000 x g'de (4 ° C'de) 1 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Et suyunun yaklaşık 800 μL'sini boşaltın ve kalan ortamı peletlenmiş hücreleri yeniden süspanse etmek için kullanın.</li>
	<li>Geri kazanılan hücreleri 2x YT agar plakasına yerleştirin.</li>
	<li>Her iki agar plakasını gece boyunca (veya yaklaşık 17 saat) 37 °C'de inkübe edin. NOT: Bu hücreler çok yavaş büyür ve çok daha uzun süre inkübe edilmeleri gerekebilir. Çok küçük başlayabilecek kolonileri tespit etmeye dikkat edin. Santrifüjlemeden sonra yeniden süspanse edilen hücreleri içeren plaka (adım 1.7), hücrelerin dönüşüm verimliliğinin zayıf olması durumunda bir yedek görevi görür, bu durumda peletlenmiş hücreler herhangi bir dönüştürülmüş hücrenin geri kazanımını iyileştirebilir. Bununla birlikte, dönüşüm verimliliği mükemmelse, konsantre hücrelerin kaplandığı agar plakası, inkübasyon sırasında aşırı büyümüş bir kültür ile karakterize edilebilir ve bu da tek kolonilerin tanımlanmasını zorlaştırır. Bu durumda, diğer agar plakası, üzerinde iyi aralıklı kolonilerin büyüdüğü plaka olabilir.</li>
</ol>2. Hücre kaplama
<ol><li>Dönüştürücülerden tek bir koloni alın ve 50 μg/mL kanamisin, E. coli dnaK756 hücrelerinin seçimi için 10 μg/mL tetrasiklin ve plazmit seçimi için 100 μg/mL ampisilin ile takviye edilmiş 10 mL 2x YT suyuna aşılayın. NOT: Kültürü çalkalarken havalandırmayı sağlamak için şişeler (≥50 mL) kullanın. Aşılamayı gece boyunca (17 saat) 37 °C'de 150 devir/dk'da çalkalayın.</li>
	<li>Ertesi sabah OD600'de bir absorbans okuması yapın.</li>
	<li>Hücre lekelenmesine hazırlık olarak yüzeyi temizlemek için tezgah yüzeyini %75 etanol kullanarak temizleyin.</li>
	<li>2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpü kullanarak, kültürü 2x YT et suyu kullanarak 2.0'lık bir OD600 okumasına standardize edin. NOT: Bu adım, çeşitli numunelerde hücre yoğunluğunu standartlaştırmak için önemli olduğundan, OD okumalarının doğru yapıldığından emin olun.</li>
	<li>2 mL mikrosantrifüj tüpleri kullanarak, hücrelerin 100 ila 10-5 arasında seri dilüsyonlarını hazırlayın.</li>
	<li>Hücreleri tespit etmek için kullanılacak agar plakalarını, su buharının dışarı çıkmasını sağlamak için kapaklar kısmen açıkken plakaların kurumasını sağlamak için 40 °C'ye ayarlanmış bir fırında inkübe edin. NOT: Hücrelerin eşit olarak ayrılmış mesafelerde tespit edildiğinden emin olmak için, üzerine bir tespit yerleri şablonunun yazdırıldığı bir kağıda çizgiler çizin.</li>
	<li>50 μg/mL kanamisin, 10 μg/mL tetrasiklin, 100 μg/mL ampisilin ve 0.5 mM IPTG (rekombinant proteinlerin ekspresyonunun indüksiyonu için) ile takviye edilmiş agar plakalarına seri olarak seyreltilmiş hücrelerin 2 μL'sini yerleştirin (bkz.</li>
	<li>Her numuneyi iki ayrı plakaya yerleştirin (biri 37 °C'de ve diğeri 43.5 °C'de inkübe edilecek). NOT: Agar plakasını delmekten kaçının.</li>
	<li>Çevresel etkileri en aza indirmek için kontrol numunelerini deney numuneleriyle aynı plakaya yerleştirin.</li>
	<li>Hücreler büyümeye başlamadan önce sürecin tamamlandığından emin olmak için lekelenmeyi hızlı bir şekilde gerçekleştirin, çünkü bu çarpık büyüme modelleri oluşturabilir. NOT: Plakaları kirleteceğinden, lekelenme sırasında aerosollerden kaçınmak önemlidir. Kontaminasyonu önlemek için plakaları lekelenme arasında kapalı tutmak da önemlidir.</li>
	<li>Bir plakayı 37 °C'de (izin verilen büyüme sıcaklığı) ve diğerini 43.5 °C'lik izin verilmeyen büyüme sıcaklığında inkübe edin. NOT: Yoğuşmuş su benekli kolonileri konumlarından yıkayacağından, kapağın üzerinde buhar birikmesini önlemek için plakaları baş aşağı bakacak şekilde inkübe edin.</li>
	<li>Tüm plakaları aynı anda inkübatörlere yerleştirin ve ertesi sabaha kadar inkübatörü açmaktan kaçının. NOT: Plakaların inkübasyonu sırasında inkübatör kapağının birkaç kez açılması önerilmez. Bunun nedeni, havanın inkübatöre erişiminin hücre büyümesini olumsuz yönde etkileyen sıcaklık dalgalanmalarına neden olabilmesidir.</li>
</ol>3. Rekombinant proteinlerin ekspresyonunun doğrulanması
<ol><li>Steril bir döngü kullanarak, kalan hücrelerin bir kısmını aynı dönüştürülmüş E. coli dnaK756 hücresi kolonisinden alın.</li>
	<li>Hücreleri, 50 μg/mL kanamisin, 10 μg/mL tetrasiklin ve 100 μg/mL ampisilin ile takviye edilmiş 10 mL YT suyuna aşılayın. Gece boyunca (17 saat) 37 °C'de 150 devir/dk'da çalkalayın.</li>
	<li>Kültürü, adım 3.2'de belirtildiği gibi gerekli antibiyotikleri içeren 90 mL steril 2x YT suyuna aktarın. Hücrelerin orta log fazına kadar büyümesine izin verin (OD600 = 0.4-0.6).</li>
	<li>İndüksiyondan önce 2 mL numune kültürü alın (0 saat indüksiyon numunesi).</li>
	<li>Protein üretimini indüklemek ve hücreleri 37 °C'de yeniden inkübe etmek için IPTG'yi 1 mM'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin.</li>
	<li>İndüksiyondan 6 saat sonra ikinci bir 2 mL numune alın.</li>
	<li>Hücreleri 10 dakika boyunca 5000 x g'da santrifüjleyerek hasat edin. Santrifüj sıcaklığını 4 °C'de tutun.</li>
	<li>Süpernatanı atın.</li>
	<li>Peleti PBS tamponunda (137 mM NaCl, 27 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4, 1.4 mM KH2PO4) tekrar süspanse edin ve -20 °C'de saklayın.</li>
</ol>4. SDS-PAGE ve western blot analizleri
<ol><li>Daha önce tarif edildiği gibi 2x %10 SDS jeli hazırlayın19.</li>
	<li>Protein bantlarını görüntülemek için Coomassie boyasını kullanarak sonraki boyama için SDS-PAGE jellerinden birini saklayın. Western blot analizi yapmak için ikinci SDS-PAGE jelini kullanın.</li>
	<li>Yeniden süspanse edilmiş numunelerin 80 μL'sini ayırın ve 20 μL 4x Laemmli SDS yükleme tamponu ile karıştırın.</li>
	<li>Süspansiyonu 100 °C'de 10 dakika kaynatın. Daha sonra her bir numuneden 10 μL prekast SDS jeli üzerine yükleyin (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
	<li>1x SDS çalışma tamponu çözeltisinde (120 mm Tris, 1 mm glisin, 250% (a/h) SDS) 0.1 V'luk bir voltaj kullanarak oda sıcaklığında 1 saat boyunca elektroforez gerçekleştirin.</li>
	<li>Jeli 1 saat boyunca Coomassie boyası ile boyayın ( Malzeme Tablosuna bakın), ardından 2 saat boyunca leke giderici tampon (%50 (h/h) metanol, %10 (h/h) asetik asit) kullanarak lekeyi çıkarın.</li>
	<li>Bir jel görüntüleme sistemi kullanarak jelde bulunan protein bantlarını görselleştirin (bkz. Başka bir SDS-PAGE jelini tekrar çalıştırınampyukarıda belirtilen protokolü izleyerek aynı sample.</li>
	<li>Elektroforetik çalışma sona erdiğinde, daha önce tarif edildiği gibi western blot analizi yapmak için SDS-PAGE jellerini alın19.</li>
	<li>Proteinlerin üzerine aktarıldığı nitroselüloz membranı yıkama tamponunda üç kez yıkayın (TBS-Tween, pH 7.4 [50 mM Tris, 150 mM NaCl, %1 (h/h) Ara]).</li>
	<li>Sırasıyla DnaK'yi tespit etmek için α-DnaK ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve KPf ve mutantı KPf-V436F'yi tespit etmek için α-PfHsp70-17'yi kullanın.</li>
	<li>Antikorları% 5 yağsız sütte 1:2000 seyreltmede kullanın. 4 °C'de 60 devir/dk'da çalkalanarak 1 saat inkübe edin.</li>
	<li>Nitroselüloz membranı TBS-Tween'de 15 dakikada 3 kez yıkayarak spesifik olarak bağlanmamış antikoru çıkarın.</li>
	<li>Membranı ikincil antikorda (α-tavşan, Malzeme Tablosuna bakınız) önceki adımla aynı koşullar altında inkübe edin. Bunu, birincil antikor ile aynı koşullar altında müteakip yıkama takip eder.</li>
	<li>Gelişmiş kemilüminesans (ECL) algılama reaktifi kullanarak bantları çözün.</li>
	<li>Bir jel görüntüleyici kullanarak bantları görselleştirin.</li>
</ol>

Escherichia coli dnaK756 Hücreleri Kullanılarak Hsp70 Şaperon Aktivitesinin Değerlendirilmesi

<ol>
	<li>Bukau, B., Deuerling, E., Pfund, C., Craig, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+newly+synthesized+proteins+into+shape.">Getting newly synthesized proteins into shape.</a> Cell. 101 (2), 119-122 (2000).</li><li>Shonhai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodial+heat+shock+proteins:+targets+for+chemotherapy.">Plasmodial heat shock proteins: targets for chemotherapy.</a> FEMS Microbiol. Immunol. 58 (1), 61-74 (2010).</li><li>Mogk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+thermolabile+Escherichia+coli+proteins:+prevention+and+reversion+of+aggregation+by+DnaK+and+ClpB.">Identification of thermolabile Escherichia coli proteins: prevention and reversion of aggregation by DnaK and ClpB.</a> EMBO J. 18 (24), 6934-6949 (1999).</li><li>Edkins, A. L., Boshoff, A., Shonhai, A., Picard, D., Blatch, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+structural+and+functional+features+of+molecular+chaperones.+Heat+shock+proteins+of+malaria.">General structural and functional features of molecular chaperones. Heat shock proteins of malaria.</a> Adv Exp Med Biol. , (2021).</li><li>Bertelsen, E. B., Chang, L., Gestwicki, J. E., Zuiderweg, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+conformation+of+wild-type+E.+coli.+Hsp70+(DnaK)+chaperone+complexed+with+ADP+and+substrate.">Solution conformation of wild-type E. coli. Hsp70 (DnaK) chaperone complexed with ADP and substrate.</a> PNAS. 106 (21), 8471-8476 (2009).</li><li>Shonhai, A., Boshoff, A., Blatch, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+heat+shock+protein+70+is+able+to+suppress+the+thermosensitivity+of+an+Escherichia+coli+DnaK+mutant+strain.">Plasmodium falciparum heat shock protein 70 is able to suppress the thermosensitivity of an Escherichia coli DnaK mutant strain.</a> Mol Genet Genomics. 274, 70-78 (2005).</li><li>Shonhai, A., Botha, M., de Beer, T. A., Boshoff, A., Blatch, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+study+of+a+Plasmodium+falciparum+Hsp70+using+three-dimensional+modelling+and+in+vitro+analyses.">Structure-function study of a Plasmodium falciparum Hsp70 using three-dimensional modelling and in vitro analyses.</a> Protein Pept Lett. 15 (10), 1117-1125 (2008).</li><li>Cockburn, I. L., Boshoff, A., Pesce, E. -. R., Blatch, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+modulation+of+plasmodial+Hsp70s+by+small+molecules+with+antimalarial+activity.">Selective modulation of plasmodial Hsp70s by small molecules with antimalarial activity.</a> Biol Chem. 395 (11), 1353-1362 (2014).</li><li>Makhoba, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+chimeric+Hsp70+to+enhance+the+quality+of+recombinant+Plasmodium+falciparum+s-adenosylmethionine+decarboxylase+protein+produced+in+Escherichia+coli.">Use of a chimeric Hsp70 to enhance the quality of recombinant Plasmodium falciparum s-adenosylmethionine decarboxylase protein produced in Escherichia coli.</a> PLoS One. 11 (3), 0152626 (2016).</li><li>Bukau, B., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+defects+caused+by+deletion+of+the+Escherichia+coli+dnaK+gene+indicate+roles+for+heat+shock+protein+in+normal+metabolism.">Cellular defects caused by deletion of the Escherichia coli dnaK gene indicate roles for heat shock protein in normal metabolism.</a> J Bact. 171 (5), 2337-2346 (1989).</li><li>Makumire, S., Revaprasadu, N., Shonhai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DnaK+protein+alleviates+toxicity+induced+by+citrate-coated+gold+nanoparticles+in+Escherichia+coli.">DnaK protein alleviates toxicity induced by citrate-coated gold nanoparticles in Escherichia coli.</a> PLoS One. 10 (4), 0121243 (2015).</li><li>Spence, J., Cegielska, A., Georgopoulos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Escherichia+coli+heat+shock+proteins+DnaK+and+HtpG+(C62.+5)+in+response+to+nutritional+deprivation.">Role of Escherichia coli heat shock proteins DnaK and HtpG (C62. 5) in response to nutritional deprivation.</a> J Bact. 172 (12), 7157-7166 (1990).</li><li>Mayer, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multistep+mechanism+of+substrate+binding+determines+chaperone+activity+of+Hsp70.">Multistep mechanism of substrate binding determines chaperone activity of Hsp70.</a> Nat Struct Biol. 7 (7), 586-593 (2000).</li><li>Georgopoulos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+bacterial+gene+(groP+C)+which+affects+&#955;+DNA+replication.">A new bacterial gene (groP C) which affects &#955; DNA replication.</a> Mol Genet Genomics. 151 (1), 35-39 (1977).</li><li>Tilly, K., McKittrick, N., Zylicz, M., Georgopoulos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dnaK+protein+modulates+the+heat-shock+response+of+Escherichia+coli.">The dnaK protein modulates the heat-shock response of Escherichia coli.</a> Cell. 34 (2), 641-646 (1983).</li><li>Buchberger, A., Gassler, C. S., Buttner, M., McMacken, R., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+defects+of+the+DnaK756+mutant+chaperone+of+Escherichia+coli+indicate+distinct+roles+for+amino-and+carboxyl-terminal+residues+in+substrate+and+co-chaperone+interaction+and+interdomain+communication.">Functional defects of the DnaK756 mutant chaperone of Escherichia coli indicate distinct roles for amino-and carboxyl-terminal residues in substrate and co-chaperone interaction and interdomain communication.</a> J Biol Chem. 274 (53), 38017-38026 (1999).</li><li>Taj, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+as+a+model+organism.">Escherichia coli as a model organism.</a> Int J Eng Res. 3 (2), 1-8 (2014).</li><li>Sato, S., Wilson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle-specific+cochaperonins+in+apicomplexan+parasites.">Organelle-specific cochaperonins in apicomplexan parasites.</a> Mol Biochem Parasitol. 141 (2), 133-143 (2005).</li><li>Molecular characterisation of the chaperone properties of Plasmodium falciparum. heat shock protein 70. Rhodes University Available from: <a target="_blank" href="https://commons.ru.ac.za/vital/access/manager/Repository/vital:3977?site_name=Rhodes+University">https://commons.ru.ac.za/vital/access/manager/Repository/vital:3977?site_name=Rhodes+University</a> (2007)</li><li>Makumire, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+GGMP+repeat+segments+of+Plasmodium+falciparum+Hsp70-1+compromises+chaperone+function+and+Hop+co-chaperone+binding.">Mutation of GGMP repeat segments of Plasmodium falciparum Hsp70-1 compromises chaperone function and Hop co-chaperone binding.</a> Int J Mol Sci. 22 (4), 2226 (2021).</li><li>Nitika, P. C. M., Truman, A. W., Truttmann, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications+of+Hsp70+family+proteins:+Expanding+the+chaperone+code.">Post-translational modifications of Hsp70 family proteins: Expanding the chaperone code.</a> J Biol Chem. 295 (31), 10689-10708 (2020).</li><li>Knighton, L. E., Saa, L. P., Reitzel, A. M., Truman, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+the+functionality+of+non-native+Hsp70+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Analyzing the functionality of non-native Hsp70 proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Bio Protoc. 9 (19), e3389 (2019).</li></ol>

Yazarların birbiriyle çelişen finansal çıkarları veya diğer çıkar çatışmaları yoktur.

Protokol, heterolog olarak eksprese edilen Hsp70'in şaperon fonksiyonunu araştırmada E. coli dnaK756hücrelerinin faydasını göstermektedir. Bu test, selülde Hsp70 fonksiyonunu hedefleyen inhibitörleri taramak için kullanılabilir. Bununla birlikte, bu yöntemin bir sınırlaması, E. coli'de DnaK'nin yerini alamayan Hsp70'lerin bu testle uyumlu olmamasıdır. Bazı doğal olmayan Hsp70'lerin translasyon sonrası modifikasyon21 eksikliği, E. coli sistem...

Isı şoku proteinleri, protein katlanmasını kolaylaştırarak, protein agregasyonunu önleyerek ve protein yanlış katlanmasını tersine çevirerek moleküler şaperonlar olarak önemli bir rol oynar 1,2. Isı şoku proteini 70 (Hsp70), protein homeostazında merkezi bir rol oynayan en önemli moleküler şaperonlardan biridir 3,4. DnaK, E. coli Hsp70 homologu5'tir.
Hsp70'in şaperon aktivitesini araştırmak ve bu şaperon 6,7,8'i hedefleyen inhibitörleri taramak için çeşitli biyofiziksel, biyokimyasal ve hücre bazlı testler geliştirilmiştir. Hsp70 yüksek oranda korunmuş bir proteindir. Bu nedenle, Plasmodium falciparum (sıtmanın ana ajanı) gibi ökaryotik organizmaların birkaç Hsp70'inin, E. coli 6,9'da DnaK fonksiyonunun yerini aldığı bildirilmiştir. Bu şekilde, sitoprotektif fonksiyonlarını araştırmak için E. coli'de Hsp70'lerin heterolog ekspresyonunu içeren bir E. coli bazlı kompleman testi geliştirilmiştir. Tipik olarak, bu tahlil, DnaK için eksik olan veya işlevsel olarak tehlikeye atılmış doğal bir DnaK'yi eksprese eden E. coli hücrelerinin kullanımını içerir. DnaK, normal koşullar altında E. coli büyümesi için gerekli olmasa da, hücreler yüksek sıcaklıklar veya diğer stres biçimleri gibi stresli koşullar altında büyütüldüğünde gerekli hale gelir10,11.
Bir tamamlama testi kullanarak Hsp70 fonksiyonunu incelemek için geliştirilen E. coli suşları arasında E. coli dnaK103 (BB2393 [C600 dnaK103 () thr::Tn10]) ve E. coli dnaK756 bulunur. E. coli dnaK103 hücreleri, işlevsel olmayan kesilmiş bir DnaK üretir ve bu nedenle, hücreler 30 °C'de yeterince büyürken, suş soğuğa ve sıcak stresineduyarlıdır 12,13. Benzer şekilde, E. coli dnaK756/BB2362 (dnaK756 recA::TcR Pdm1,1) suşu 40 °C'nin üzerinde büyümez14,15. E. coli dnaK756 suşu, 32, 455 ve 468 pozisyonlarında üç glisin-aspartat ikamesi ile karakterize edilen ve tehlikeye atılmış proteostatik sonuçlara yol açan mutant bir doğal DnaK'yi (DnaK756) eksprese eder. Sonuç olarak, bu suş bakteriyofaj λ DNA14'e dirençlidir. Ek olarak, E. coli dnaK756, yüksek ATPaz aktivitesi sergilerken, nükleotid değişim faktörü GrpE'ye olan afinitesi azalır16. E. coli DnaK mutant suşları, bir tamamlama yaklaşımı ile Hsp70'in şaperon aktivitesini araştırmak için ideal modeller olarak hizmet eder. DnaK sadece stresli koşullar altında gerekli olduğundan, tamamlama testi tipik olarak yüksek sıcaklıklarda gerçekleştirilir (Şekil 1). Bu çalışma için E. coli kullanmanın bazı avantajları arasında iyi karakterize edilmiş genomu, hızlı büyümesi ve düşük kültür ve bakım maliyetiyer alır 17.
Bu yazıda, Hsp70'in işlevini incelemek için E. coli dnaK756 hücrelerinin kullanımını içeren bir protokolü ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Testte kullandığımız Hsp70'ler, vahşi tip DnaK ve onun kimerik türevi KPf'dir (Plasmodium falciparum Hsp70-1 6,18'in C-terminal substrat bağlama alanına kaynaşmış DnaK'nin ATPaz alanından oluşur). KPf-V436F, heterolog olarak negatif bir kontrol olarak ifade edildi, çünkü mutasyon esasen onu substratların bağlanmasını bloke eder, böylece şaperon aktivitesini iptal eder9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>8,05,740</td>
			<td>Constituent for sample loading dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Labchem</td>
			<td>101005125</td>
			<td>Constituent of destainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>8008300100</td>
			<td>Component of SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>HG000BX1.500</td>
			<td>Constituent of medium and liquid growth assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Clever Scientific</td>
			<td>14131031</td>
			<td>Certified molecular biology agarose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>101875295</td>
			<td>Constituent for SDS-PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>0339&#8212;EU&#8212;25G</td>
			<td>Selective antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>1015460100</td>
			<td>Component of SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>0449-25G</td>
			<td>Constituent for sample loading dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td>For competent cells preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie brilliant blue</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>443293X</td>
			<td>SDS-PAGE dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic sodium phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RB10368</td>
			<td>Constituent of PBS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td>32109</td>
			<td>Western blot detection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td>17898</td>
			<td>DNA intercalating dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SAAR2676520L</td>
			<td>Constituent for sample loading dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>10119CU</td>
			<td>Component of SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Glentham life sciences</td>
			<td>162IL</td>
			<td>inducer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Melford</td>
			<td>K0126</td>
			<td>Selective antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SAAR4123000EM</td>
			<td>Constituent of medium and liquid growth assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Labchem</td>
			<td>113140129</td>
			<td>Constituent of destainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monobasic potassium phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,04,87,30,250</td>
			<td>Constituent of PBS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>HG000BX4.250</td>
			<td>Constituent of medium and liquid growth assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SAAR5042020EM</td>
			<td>Constituent of PBS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Thermofischer scientific</td>
			<td>PB7320</td>
			<td>Western blot membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SAAR5822320EM</td>
			<td>Constituent of medium and liquid growth assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>108073</td>
			<td>To resolve expressed proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectramax iD3</td>
			<td>Separations</td>
			<td>373705019</td>
			<td>Automated plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>ACRO420580500</td>
			<td>Component of SDS gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Duchefa Biochemies</td>
			<td>T0150.0025</td>
			<td>Selective antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>19A094101</td>
			<td>Component of SDS gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SAAR3164500XF</td>
			<td>Constituent for Western wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western transfer chamber</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>PB0112</td>
			<td>Transfer of protein to nitrocellulose membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Merck</td>
			<td>HG000BX6.500</td>
			<td>Constituent of medium and liquid growth assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-DnaK antibody</td>
			<td>Inqaba</td>
			<td>BK CAC09317</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-rabbit antibody</td>
			<td>Thermofischer scientific</td>
			<td>31460</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

escherichia coli -based complementation assay to study the chaperone function of heat shock protein 70

Isı şoku proteini 70 (Hsp70), hücre içindeki diğer proteinlerin katlanmasını kolaylaştıran ve onu moleküler bir şaperon yapan korunmuş bir proteindir. Hsp70, normal koşullar altında büyüyen E. coli hücreleri için gerekli olmasa da, bu şaperon yüksek sıcaklıklarda büyüme için vazgeçilmez hale gelir. Hsp70 yüksek oranda korunduğundan, çeşitli türlerden Hsp70 genlerinin şaperon fonksiyonunu incelemenin bir yolu, onları Hsp70'te eksik olan veya işlevsel olarak tehlikeye atılmış doğal bir Hsp70'i eksprese eden E. coli suşlarında heterolog olarak ifade etmektir. E. coli dnaK756 hücreleri, λ bakteriyofaj DNA'sını destekleyemez. Ayrıca, doğal Hsp70 (DnaK), GrpE (Hsp70 nükleotid değişim faktörü) için azalmış afinite gösterirken yüksek ATPaz aktivitesi sergiler. Sonuç olarak, E. coli dnaK756 hücreleri, 30 °C ila 37 °C arasında değişen sıcaklıklarda yeterince büyür, ancak yüksek sıcaklıklarda (>40 °C) ölürler. Bu nedenle, bu hücreler Hsp70'in şaperon aktivitesini incelemek için bir model görevi görür. Burada, Hsp70'in selülo şaperon fonksiyonunun incelenmesini sağlayan bir tamamlama testi yapmak için bu hücrelerin uygulanması için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz.

Heat shock proteins play an important role as molecular chaperones by facilitating protein folding, preventing protein aggregation, and reversing protein misfolding1,2. Heat shock protein 70 (Hsp70) is one of the most prominent molecular chaperones, playing a central role in protein homeostasis3,4. DnaK is the E. coli Hsp70 homologue5.
Various biophysical, biochemical, and cell-based assays have been developed to explore the chaperone activity of Hsp70 and to screen for inhibitors targeting this chaperone6,7,8. Hsp70 is a highly conserved protein. For this reason, several Hsp70s of eukaryotic organisms, such as Plasmodium falciparum (the main agent of malaria), have been reported to substitute for DnaK function in E. coli6,9. In this way, an E. coli-based complementation assay has been developed involving the heterologous expression of Hsp70s in E. coli to explore their cytoprotective function. Typically, this assay involves the utilization of E. coli cells that are either deficient for DnaK or that express a native DnaK that is functionally compromised. While DnaK is not essential for E. coli growth under normal conditions, it becomes essential when the cells are grown under stressful conditions such as elevated temperatures or other forms of stress10,11.
E. coli strains that have been developed to study Hsp70 function using a complementation assay include E. coli dnaK103&#160;(BB2393 [C600 dnaK103(Am) thr::Tn10]) and E. coli dnaK756. E. coli dnaK103&#160;cells produce a truncated DnaK that is non-functional, and as such, the cells grow adequately at 30 &#176;C, while the strain is sensitive to cold and heat stress12,13. Similarly, the E. coli dnaK756/BB2362 (dnaK756&#160;recA::TcR Pdm1,1) strain does not grow above 40 &#176;C14,15. The E. coli dnaK756&#160;strain expresses a mutant native DnaK (DnaK756) characterized by three glycine-to-aspartate substitutions at positions 32, 455, and 468, giving rise to compromised proteostatic outcomes. Consequently, this strain is resistant to bacteriophage &#955; DNA14. Additionally, E. coli&#160;dnaK756 exhibits elevated ATPase activity, while its affinity for the nucleotide exchange factor, GrpE, is reduced16. E. coli DnaK mutant strains serve as ideal models for investigating the chaperone activity of Hsp70 through a complementation approach. Since DnaK is only essential under stressful conditions, the complementation assay is typically conducted at elevated temperatures (Figure 1). Some advantages of using E. coli for this study include its well-characterized genome, rapid growth, and the low cost of culturing and maintenance17.
In this article, we describe in detail a protocol involving the use of E. coli dnaK756&#160;cells to study the function of Hsp70. The Hsp70s we employed in the assay are wild-type DnaK and its chimeric derivative, KPf (made up of the ATPase domain of DnaK fused to the C-terminal substrate-binding domain of Plasmodium falciparum Hsp70-16,18). KPf-V436F was heterologously expressed as a negative control since the mutation essentially blocks it from binding substrates, thus abrogating its chaperone activity9.

Yazar Spotlight: Sıtma ve Tüberküloz Enfeksiyonlarında Isı Şoku Proteinlerini Keşfetmek

Isı Şoku Proteininin Şaperon Fonksiyonunu İncelemek için Escherichia coli Bazlı Tamamlama Testi 70

I study the role of heat shock proteins in conferring future static protection to antigens that cause human infections such as malaria and tuberculosis. My research essentially focuses on the structure and function features of the heat shock protein machinery of these pathogens that cause human infections. Heatstroke proteins are generally highly concept, however, they display some level of functional specialization.In addition, they are implicated in drug resistant. As such, there are ongoing efforts to target them towards reversing drug resistance in various disease models. They include biochemical, biophysical, bioinformatics, and cell biologic techniques.In other words, various areas of techniques are used to study the roles of these proteins. In our case, the study of proteins of Plasmodium was the main agent of malaria and that they are difficult to produce and this limits the capability to study these proteins. For example, it is difficult to generate sufficient levels to crystallize and image the proteins.We have established some of the functional networks of these proteins in the malaria parasite. We have also established assays to study the compounds targeting these proteins in agents causing malaria and TB.The current protocol is used to explore the chaperone protein folding role and then cytoprotective function of HSP 70 using equal as a model. The protocol could also be adopted for screening small molecule inhibitors targeting protein 70.

Şekil 2, sırasıyla 37 °C ve 43.5 °C'lik izin verilen büyüme sıcaklığında tespit edilen ve kültürlenen hücreleri içeren taranmış agar görüntüsünü, göstermektedir. Şekil 2'nin sağ tarafında, eksize edilen western blot bileşenleri, E. coli dnaK756 hücrelerinde DnaK, KPf ve KPf-V436F'nin ekspresyonunu temsil eder. Beklendiği gibi, 37 ° C'lik izin verilen büyüme sıcaklığında kültürlenen tüm E. coli dnaK756 hüc...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Exploring Heat Shock Proteins in Malaria and Tuberculosis Infections at JoVE.com

Bu protokol, ısı şoku proteini 70'in (Hsp70) şaperon aktivitesini gösterir. E. coli dnaK756 hücreleri, doğal, işlevsel olarak bozulmuş bir Hsp70 barındırdıkları için test için bir model görevi görür ve bu da onları ısı stresine duyarlı hale getirir. Fonksiyonel Hsp70'in heterolog girişi, hücrelerin büyüme eksikliğini kurtarır.

Heat shock protein 70 (Hsp70) is a conserved protein that facilitates the folding of other proteins within the cell, making it a molecular chaperone. ...

Isı şoku proteinlerinin, sıtma ve tüberküloz gibi insan enfeksiyonlarına neden olan antijenlere gelecekteki statik koruma sağlamadaki rolünü inceliyorum. Araştırmam temel olarak insan enfeksiyonlarına neden olan bu patojenlerin ısı şoku protein mekanizmasının yapı ve işlev özelliklerine odaklanmaktadır. Sıcak çarpması proteinleri genellikle oldukça kavramsaldır, ancak bir miktar fonksiyonel uzmanlaşma gösterirler.Ek olarak, ilaca dirençli olarak rol oynarlar. Bu nedenle, çeşitli hastalık modellerinde ilaç direncini tersine çevirmeye yönelik çabalar devam etmektedir. Biyokimyasal, biyofiziksel, biyoinformatik ve hücre biyolojik tekniklerini içerir.Başka bir deyişle, bu proteinlerin rollerini incelemek için çeşitli teknikler kullanılır. Bizim durumumuzda, Plasmodium proteinlerinin incelenmesi sıtmanın ana ajanıydı ve bunların üretilmesi zordu ve bu da bu proteinleri inceleme yeteneğini sınırlıyor. Örneğin, proteinleri kristalleştirmek ve görüntülemek için yeterli seviyeler oluşturmak zordur.Sıtma parazitinde bu proteinlerin bazı fonksiyonel ağlarını kurduk. Ayrıca, sıtma ve tüberküloza neden olan ajanlarda bu proteinleri hedef alan bileşikleri incelemek için tahliller oluşturduk. Mevcut protokol, eşiti model olarak kullanarak HSP 70'in şaperon proteininin katlanma rolünü ve daha sonra sitoprotektif işlevini araştırmak için kullanılır. Protokol, protein 70'i hedefleyen küçük molekül inhibitörlerinin taranması için de benimsenebilir.

escherichia-coli-based-complementation-assay-to-study-chaperone

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Escherichia coli -Based Complementation Assay to Study the Chaperone Function of Heat Shock Protein 70

680 Görüntüleme.  University of Venda. Isı şoku proteinlerinin, sıtma ve tüberküloz gibi insan enfeksiyonlarına neden olan antijenlere gelecekteki statik koruma sağlamadaki rolünü inceliyorum. Araştırmam temel olarak insan enfeksiyonlarına neden olan bu patojenlerin ısı şoku protein mekanizmasının yapı ve işlev özelliklerine odaklanmaktadır. Sıcak çarpması proteinleri genellikle oldukça kavramsaldır, ancak bir miktar fonksiyonel uzmanlaşma gösterirler.Ek olarak, ilaca dirençli olarak rol oynarla...

Video: Yazar Spotlight: Sıtma ve Tüberküloz Enfeksiyonlarında Isı Şoku Proteinlerini Keşfetmek

Heat shock protein 70 (Hsp70) is a conserved protein that facilitates the folding of other proteins within the cell, making it a molecular chaperone. While Hsp70 is not essential for E. coli cells growing under normal conditions, this chaperone becomes indispensable for growth at elevated temperatures. Since Hsp70 is highly conserved, one way to study the chaperone function of Hsp70&#160;genes from various species is to heterologously express them in E. coli strains that are either deficient in Hsp70 or express a native Hsp70 that is functionally compromised. E. coli dnaK756&#160;cells are unable to support &#955; bacteriophage DNA. Furthermore, their native Hsp70 (DnaK) exhibits elevated ATPase activity while demonstrating reduced affinity for GrpE (Hsp70 nucleotide exchange factor). As a result, E. coli dnaK756&#160;cells grow adequately at temperatures ranging from 30 &#176;C to 37 &#176;C, but they die at elevated temperatures (&#62;40 &#176;C). For this reason, these cells serve as a model for studying the chaperone activity of Hsp70. Here, we describe a detailed protocol for the application of these cells to conduct a complementation assay, enabling the study of the in cellulo chaperone function of Hsp70.

This protocol demonstrates the chaperone activity of heat shock protein 70 (Hsp70). E. coli dnaK756 cells serve as a model for the assay as they harbor a native, functionally impaired Hsp70, making them susceptible to heat stress. The heterologous introduction of functional Hsp70 rescues the growth deficiency of the cells.