Başlamak için, 15 santimetre çapında 10 işlenmiş kültür kabına 22 mililitre ek kültür ortamı ekleyerek hücreleri HEK293T plakalayın. % 70 ila 80 birleşme oranına ulaşmak için plakaları 24 saat inkübe edin. Hücre transfeksiyonu için, reaktifleri bir mikrosantrifüj tüpünde birleştirerek bir karışım hazırlayın ve hafifçe vurarak karıştırın.
Transfeksiyon karışımını 50 mililitrelik bir santrifüj tüpünde 4.56 mililitre takviye edilmemiş DMEM'e ekleyin ve hafifçe vurarak karıştırın. Ardından, damla damla 1.37 mililitre steril polietilenimin çözeltisi ekleyin. Hafifçe vurarak karıştırın ve DNA polietilenimin kompleksleri oluşturmak için oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
Bu karışımı 231 mililitre önceden ısıtılmış takviye edilmiş DMEM'e ekleyin. Her kültür kabındaki kültür ortamını bu transfeksiyon karışımından 22 mililitre ile değiştirin ve hücreleri 48 saat inkübe edin. PITR bir floresan raportörü kodluyorsa, transfekte edilmiş hücreleri bir floresan mikroskobu altında gözlemleyin.
Sonra, her tabaktan ortamı toplayın. 800G'de 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Ardından, plakaya 10 mililitre önceden ısıtılmış PBS ekleyin ve hücreleri çıkarmak için bir hücre kazıyıcı kullanın.
Hücre süspansiyonunu, hücre peletini içeren santrifüj tüplerine toplayın. 10 mililitre PBS ile bir seferde beş bulaşık yıkayarak tüm hücrelerin toplandığından emin olun. Hücreleri peletlemek için tekrar santrifüjleyin.
rAAV ekstraksiyonu için, transfekte edilmiş hücre peletlerini çözün ve homojen bir süspansiyon sağlamak için 100 mililitre steril tampon ve pipet içinde yeniden süspanse edin. Ardından, hücre lizizini indüklemek için 12,5 mililitre taze hazırlanmış, steril% 10 sodyum deoksikolat çözeltisi ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. 27 mikrolitre Benzonaz nükleaz ekleyin ve karışım artık viskoz olmayana kadar iyice karıştırın.
37 santigrat derecede inkübe edin, her 10 dakikada bir saat boyunca girdap yapın. 25 santigrat derecede 60 dakika boyunca 3.000G'de santrifüjleyin. 0,45 mikron PVDF şırınga filtresi kullanarak süpernatanı yeni bir steril kaba filtreleyin.
