Başlamak için, FPLC sistemini saflaştırma için hazırlayın. Manuel talimatlar veya özelleştirilmiş bir yöntem kullanarak sıvı akış yolunu steril ultra saf suyla iyice durulayın. Bir mililitrelik önceden paketlenmiş bir heparin sütunu bağlayın.
Basınç alarmını ayarlayın. Ve dakikada bir mililitre akış hızında beş sütun hacminde ultra saf su ile yıkayın. Ardından, örnek uygulamaya hazırlanmak için sistem pompalarının çözümlerini değiştirin.
Sistem Pompası B'yi Tampon B ile yıkayın ve sıvı akış yolunun geri kalanını Tampon A ile doldurun. Alternatif olarak, örnek için bir süper döngü kullanın. Çıkış borusunu yeni bir kaba yerleştirin.
Saflaştırmayı ilk kez gerçekleştirirken, otomatik saflaştırma için özelleştirilmiş bir yöntem tanımlayın. Genel saflaştırma ayarlarını etkinleştirdikten sonra, yöntem, numune girişi S1'den numune çözeltisi ile enjeksiyon valfine akış yolunu hazırlayacaktır. Ardından, dakikada bir mililitre hızında Tampon B'nin %12,5'ini kullanarak sütunu toplam beş sütun hacmiyle dengeleyin.
Numuneyi dakikada 0,5 mililitre hızla kolona uygulayın ve çıkış portunu kullanarak akışı toplayın. Sütunu dakikada bir mililitre hızında 20 sütun hacmi Tampon A ile yıkayın. Daha sonra bu şema ile numuneyi dakikada bir mililitre olarak elüte edin.
Ayrıştırılan numuneyi bir fraksiyon toplayıcı kullanarak bir mililitrelik fraksiyonlar halinde toplamak için seçin. Ardından, beş sütun hacmi için sütunu dakikada bir mililitre ile Tampon B'nin %12,5'i ile yeniden dengeleyin. Oluşturulan yöntemi açın ve elüsyon adımını bekleyin.
Bir kesir toplayıcı kullanarak kesirleri toplayın. Ayrıca, akışın bir kısmını toplayın ve fraksiyonları eksi 20 santigrat derecede saklayın. Tüm saflaştırma adımlarının otomatik olarak kaydedilen kromatogramını değerlendirin.
Elüsyon profili dahil. Tamamlandıktan sonra, girişleri tampon çözeltilerinden ultra saf suya geçirin ve sütunu beş sütun hacmi için dakikada bir mililitre yıkayın. Sütunu eski haline getirerek, girişleri ultra saf sudan %20 etanole geçirin ve sütunu beş sütun hacmi boyunca yıkayın.
rAAV'leri konsantre etmek için, istenen FPLC fraksiyonlarını 100 kilodalton moleküler ağırlık kesme ile 15 mililitrelik bir santrifüj filtre ünitesine yükleyin. Yaklaşık 500 mikrolitrelik konsantre bir hacme ulaşmak için oda sıcaklığında iki dakika boyunca 2.000 G'de santrifüjleyin. Santrifüj filtre ünitesine bir mililitre steril PBS ekleyerek tampon değişimine devam edin.
Filtreyi pipetleyerek yıkayın. Ve 500 mikrolitre hacme ulaşana kadar bir dakikalık aralıklarla santrifüjleyin. Bu 500 mikrolitrelik numuneyi, 100 kilodaltonluk bir kesme ile 0,5 mililitrelik bir santrifüj filtre ünitesine aktararak rAAV'leri daha da konsantre edin.
Ve hacim 100 mikrolitreden az olana kadar bir dakikalık aralıklarla 6.000 G'de santrifüjleme. Filtre cihazını yeni bir mikro santrifüj tüpüne ters çevirerek ve rAAV'leri tüpe aktarmak için santrifüjleyerek konsantre rAAV'yi geri kazanın. rAAV'leri düşük retansiyonlu mikrosantrifüj tüplerine ayırın ve eksi 80 santigrat derecede saklayın.
rAAV preparatlarının saflığı, SDS sayfası kullanılarak analiz edildi ve farklı kapsid protein bantları ortaya çıkarıldı. Viral parçacıkların TEM ile görselleştirilmesi, elektron yoğun bir merkeze sahip boş parçacıklar ve dolu parçacıklar gösterdi. Sersemletici platform kullanılarak rAAV'lerin fiziksel safsızlık özelliklerinin değerlendirilmesi, 30 nanometre civarında bozulmamış kapsid parçacıkları, genel kapsid titresi, serbest ve agrega protein ve tek sarmallı DNA ortaya çıkardı.
Nöro 2a hücrelerindeki enfektivite testleri yüksek enfektivite seviyeleri gösterdi. Viral preparatlarla enfekte olmuş primer nöronal kültürler gösterilmiştir. korunmuş gen transfer özellikleri.
Fare serebellumunun rAAV vektörleri ile in vivo transdüksiyonu, uzamış GFP ekspresyonu ile sonuçlandı. Memeli beyninde başarılı bir transgen ekspresyonunu gösterir.
