Başlamak için, 10 mikrolitrelik damlacıklar 2X peptit çözeltisini, 24 oyuklu bir plakadaki kuyuların merkezlerine pipetleyin. İnkübasyondan sonra, her bir oyuğa 10 mikrolitre 2X PBS pipetleyin. Solüsyonu nazikçe karıştırmak için pipetin ucunu kullanın, jel damlacıklarının en az 20 dakika stabilize olmasına izin verin ve damlacıkların sağlam olduğundan emin olun.
Daha sonra, 2.5 mililitre% 0.0125 tripsin EDTA'yı 2 milyon SW1222 insan kolorektal adenokarsinomu hücresi içeren bir şişeye pipetleyin. Hücreleri, şişeden ayrılana kadar beş ila 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede tripsin ile inkübe edin. Tripsini etkisiz hale getirmek için beş mililitre tam ortam ekleyin.
Daha sonra 30 mikrometrelik bir hücre süzgeci kullanarak hücre süspansiyonunu filtreleyin. 10 mikrolitrelik bir mikro pipetle, her peptit damlacığına iki mikrolitre hücre süspansiyonu enjekte edin. SW1222 hücre hattından 800 hücreyi dört gün boyunca her bir oyuğa tohumlayın.
Damlacıkları% 5 karbondioksit altında 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Daha sonra her bir oyuğa 0,5 mililitre takviye edilmiş ortam ekleyin. Kontrolü hazırlamak için, bazal membran matris kontrolünün stoğunu takviye edilmiş ortamla seyreltin.
Hücre süspansiyonunu seyreltilmiş membran bazal çözeltisine yükleyin. Hücrelerle birlikte her bir oyuğa 20 mikrolitre seyreltilmiş bazal membran matrisi pipetleyin. Hücreleri 37 santigrat derecede 20 dakika inkübe edin.
Damlacıklar katılaştıktan sonra, 0,5 mililitre tam ortam ekleyin. Organoid büyümesini değerlendirmek için hücreleri bir, dördüncü ve yedinci günlerde parlak alan mikroskobu kullanarak görüntüleyin. Hücrelerin bir haftalık parlak alan görüntülemesi, küçük hücre kümelerinin organoidler halinde toplandığını gösterdi.
Peptit hidrojellerde kültürlenen SW1222'den türetilmiş organoidler, hafif bir görünüme sahip yuvarlak bir morfolojiye sahipti. Daha koyu bir görünüm, yedinci günde Peptit P'deki kolonilerde görüldüğü gibi istenmeyen daha yüksek yoğunluğu gösterdi.
