Başlamak için, 20 mikrolitrelik peptit hidrojel damlacıklarını 24 oyuklu bir plakaya pipetleyin. SW1222 hücre hattından 800 hücreyi dört gün boyunca her bir oyuğa tohumlayın. Dördüncü günde, ortamı pipetleyin.
Her kuyuyu PBS ile iki kez yıkayın. Daha sonra kuyucuklara 400 mikrolitre% 4 formaldehit çözeltisi ekleyin. İnkübasyon tamamlandıktan sonra, formaldehit çözeltisini aspire etmek için bir P1000 pipet ucu kullanın.
Ardından, kuyuları bir kez daha PBS ile yıkayın. Hücreleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bir mililitre geçirgenlik tamponunda inkübe edin. Tamponu pipetledikten ve kuyucukları PBS ile yıkadıktan sonra, 0,5 mililitre bloke edici tampon ekleyin.
Şimdi, blokaj tamponunu çıkardıktan sonra kuyuları PBS ile yıkayın. Daha sonra, 200 mikrolitre seyreltilmiş primer antikoru kuyucuklara pipetleyin. Plakayı gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.
Bir P200 pipet ucuyla çözeltiyi çıkarın. Daha sonra kuyuları PBS solüsyonu ile yıkayın. Daha sonra, bir ila 40 oranında seyreltilmiş ikincil antikor şişesine falloidin konjugatı ekleyin.
Bu karışımı plakanın kuyucuklarına pipetleyin. Ardından, plakayı karanlıkta üç saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Çözeltiyi aspire ettikten ve kuyuları PBS ile yıkadıktan sonra, her bir kuyucuğa 300 mikrolitre DAPI çözeltisi pipetleyin.
İnkübasyondan sonra, çözeltiyi pipetledikten sonra kuyuları tekrar PBS ile yıkayın. Plakayı yedi güne kadar dört santigrat derecede saklayın. İmmün boyama, biyofonksiyonel olmayan peptit P, biyofonksiyonelleştirilmiş peptit P1 ve Matrigel'de bulunan organoidlerin apikal ve bazolateral membranlarda lokalize olduğunu gösterdi.
Biyofonksiyonel olmayan peptit P, bazolateral membranda hücre-hücre bağlantı ekspresyonunu indükledi.
