Başlamak için, bir şişe dondurularak saklanmış HUVEC'leri iki dakika boyunca 37 derecelik bir su banyosuna batırın. Daha sonra kontaminasyonu önlemek için şişeyi% 70 etanol ile durulayın. Beş mililitre önceden ısıtılmış EKGM'yi 15 mililitrelik konik bir tüpe pipetleyin.
Bir mikropipet ile, çözülmüş hücreleri flakondan konik tüpe dikkatlice aktarın. Ardından, içini durulamak ve kalan hücreleri konik tüpe aktarmak için kriyoviyal içine bir mililitre taze önceden ısıtılmış ortam ekleyin. Süpernatanı attıktan sonra, hücreleri 10 mililitre taze ortamda yeniden süspanse edin.
Ardından hücreleri bir T75 şişesine aktarın. Şişeyi 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir karbondioksit inkübatörde inkübe edin. %90 birleşik HUVEC hücrelerini 10 mililitre DPBS ile bir T75 şişesinde durulayın.
Ardından şişeye bir mililitre% 0.25 TE ekleyin. İnkübasyondan sonra, şişenin kenarlarına hafifçe vurun ve beş mililitre tripsin nötralize edici çözelti ekleyin. Daha sonra hücreleri 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.
Kalan hücreleri beş mililitre taze EKGM ile toplayın ve bunları konik tüpe aktarın. Şimdi hücre peletini toplamak için konik tüpü 250 x g'da üç dakika santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan sonra, hücre peletini bir mililitre taze EKGM'de yeniden süspanse edin ve hücreleri sayın.
Tekrar santrifüjledikten sonra, süpernatanı atın ve hücreleri 90 mikrolitre taze EKGM'de yeniden süspanse edin. Ardından, lümeni temizlemek için plaka üzerindeki baskılı kapların kanallarını kısa bir süre vakumla emdirin. Bir mikropipet ile kanala 15 mikrolitre HUVEC hücre süspansiyonu ile nazikçe yükleyin.
Plakayı iki saat boyunca bir inkübatörün içine düz bir şekilde yerleştirin. Daha sonra, plakayı 180 dereceye ters çevirin ve sonraki iki saat boyunca düz bir konumda tutun. Dört saat sonra, yapışmayan ve ölü hücreleri çıkarmak için kanalı DPBS ile yıkayın.
Daha sonra her bir kuyucuğa iki mililitre taze EKGM pipetleyin. Dinamik kültürü 10 derecelik eğim açısında ve beş RPM'de bir külbütöre yerleştirin. HUVEC hücreleri, VOP'un vasküler kanallarının lümen yüzeyini kaplamak için hızla bağlandı ve çoğaldı.
Endotelin olgunlaşması, hücre tohumlamasından 5 gün sonra CD31 için immün boyama ile doğrulandı ve bu da CD31'in sıkı bağlantılarda lokalizasyonunu gösterdi.
