Notexin Yaralı Farelerden İzole Edilen İskelet Kası Hücrelerinin Sisplatin ve Paraformaldehit Fiksasyonu ile Canlı / Ölü Boyanması

Başlamak için, bir mililitre soğuk serum içermeyen DMEM'de iyododeoksiüridin ile etiketlenmiş Notexin ile yaralanmış farelerden izole edilen iskelet kası hücrelerini yeniden askıya alın ve bunları bir hemositometre veya hücre sayacı kullanarak sayın. Bir çeker ocak altında, 25 mikromolar nihai konsantrasyon elde etmek için sisplatin stoğu ekleyin. Tüpü 10 saniye boyunca vorteksleyin ve oda sıcaklığında bir dakika inkübe edin.

% 10 FBS içeren buz gibi soğuk DMEM ile reaksiyonu söndürün ve buzun üzerine yerleştirin. Hücreleri peletledikten ve yeniden süspanse ettikten sonra, süspansiyonu 35 mikrometrelik bir hücre süzgecinden süzün. Bir çeker ocak altında, hücre süspansiyonunu ve girdabı 30 saniye boyunca sabitlemek için filtrelenmiş paraformaldehit stok çözeltisi ekleyin.

Santrifüjleme ile iki mililitre hücre boyama ortamı veya CSM ile iki kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, süpernatanı yaklaşık 60 mikrolitreye aspire edin ve peleti iyice yeniden süspanse edin. CSM'de hazırlanan 2,5 kat yüzey antikor boyama karışımından 40 mikrolitre ekleyin ve her 20 dakikada bir vorteksleyerek bir saat inkübe edin.

Numuneyi CSM ile iki kez yıkadıktan sonra, süpernatanı aspire edin ve peleti hafifçe vurun. Hücrelere nüfuz etmek için, bir davlumbaz altında, girdap yaparken damla damla 0,5 mililitre buz gibi metanol ekleyin. Hücreleri santrifüjleme ile bir mililitre CSM ile iki kez yıkayın.

Son yıkamadan sonra, süpernatanı yaklaşık 60 mikrolitreye aspire edin ve peleti iyice yeniden süspanse edin. Hücreleri 40 mikrolitre hücre içi antikor boyama karışımı ile bir saat boyunca inkübe ederken, numuneleri her 20 dakikada bir girdaplayın. Hücreleri bir mililitre CSM ile iki kez yıkadıktan sonra, numuneleri 0,5 mililitre interkalatör iridyum çözeltisi ve girdap içinde yeniden süspanse edin.