Başlamak için, üreticinin talimatlarına göre O2K solunum cihazına 0,5 mililitrelik odalar takın. Enstrümanı açın ve veri toplama için sağlanan yazılıma bağlayın. Odaları üç kez deiyonize su ile yıkayın.
Suyu 0,54 mililitre MiR05 ile değiştirin ve tıpaları tamamen kapatın. Fazla tamponu çıkardıktan sonra, oda oksijeninin oda oksijeni ile dengelenmesini sağlamak için tıpaları kaldırın. Manyetik hücre ayırıcının manyetik alanına bir sütun yerleştirin ve sütunu üç mililitre RP5 ile yıkayın.
Yeni izole edilmiş periferik kan mononükleer hücresini veya PBMC peletini, 20 mikrolitre anti CD14 mikroboncuk ile birlikte 80 mikrolitre RP5 içinde yeniden süspanse edin. Hücreleri dört santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Süspansiyonu kolona yüklemeden önce hücreleri bir mililitre RP5 ile seyreltin.
Birinden akış olarak etiketlenmiş 15 mililitrelik konik bir tüpe akan etiketlenmemiş hücreleri toplayın "Sıvının içinden akışı toplamak için sütunu üç mililitre RP5 ile üç kez yıkayın. Sütunu manyetik alandan dikkatlice çıkarın ve 15 mililitrelik yeni bir konik tüpe yerleştirin. Beş mililitre RP5 ekledikten sonra, içeriği tüpe toplamak için pistonu kolona itin.
Akışı bir tüpten santrifüjledikten sonra, T lenfositleri elde etmek için hücrelerle anti CD3 mikro boncukları kullanarak izolasyon adımlarını tekrarlayın. CD3 pozitif T hücreleri ve CD14 pozitif monositler içeren hücreleri santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan sonra, peleti bir mililitre RP5 içinde yeniden süspanse edin.
Bir hemositometre kullanarak hücre konsantrasyonunu belirleyin. Yeni santrifüj tüplerine 2,5 milyon monosit ve 5 milyon T hücresi ekleyin. Hücreleri pelet haline getirin ve 20 mikrolitre MiR05 içinde yeniden süspanse edin.
Floresan sensörleri takın ve O2K respirometre ünitesinde bir deney dosyası başlatın. AMR filtre seti ile yeşil LED floresan sensörleri kullanarak florometre kazancını ve yoğunluğunu 1000'e ayarlayın. Hazne hacmini 0,5 mililitreye ayarlayın ve hem oksijen akışını hem de TMRM floresansını görmek için düzeni ayarlayın.
Oksijen akışı stabil hale geldiğinde, hava oksijen kalibrasyonunu üreticinin protokolüne göre gerçekleştirin. Hazneyi kapatmak için tıpaları kapatın. Bir Hamilton şırınga kullanarak, dört kez 2.5 mikrolitre 0.05 milimolar tetrametilrodamin metil ester veya TMRM enjekte edin.
Akış sensörünü, TMRM'nin 0, 0.25, 0.5, 0.75 ve 1.0 mikromolarını temsil eden her enjeksiyon için bir floresan sinyaliyle kalibre edin. Boş deneyi çalıştırmak için 20 mikrolitre MiR05 enjekte edin. Oksijen akışı stabilize olduktan sonra, hem oksijen akışını hem de TMRM sinyalini ön hücre olarak seçin ve etiketleyin.
Hücreleri içeren 20 mikrolitre hücre süspansiyonu enjekte edin ve yaklaşık 10 dakika boyunca ölçün. Ardından hem oksijen akışını hem de TMRM sinyallerini hücre olarak seçin ve etiketleyin. Daha sonra her tedavi için adımları sırayla tekrarlayın ve oksijen akışını ve TMRM sinyalini uygun şekilde etiketleyin.
Oksijen akışı stabil olduğunda, mitokondriyal solunumu engellemek için bir mikrolitre 1.25 milimolar antimisin A enjekte edin. Her boş deney için, arka plan oranını hesaplamak için ön numune TMRM konsantrasyonunu bire ayarlayın. TMRM'deki sonraki orantılı azalmayı ve tüm boş deneylerden elde edilen ortalama arka plan oranını hesaplayın.
Ardından, numune deneyinin ön numune TMRM'sini, her bir numune deneyinin her enjeksiyonu için ortalama arka plan oranıyla çarpın. Deneyin arka planını, numunenin ölçülen TMRM değerlerine çıkarın. Daha sonra, her enjeksiyondan FCCP arka plan düzeltilmiş mitokondriyal membran potansiyelini çıkarın.
ADP güdümlü azalmayı normalleştirmek için, en yüksek ve en düşük membran potansiyelini sırasıyla %100 ve %0 olarak ayarlayın ve verileri doğrusal olmayan bir uyum regresyon modeline sığdırın. Sağlıklı gönüllülerden alınan T hücreleri ve monositlerde ADP kaynaklı değişiklikler üzerine yapılan karşılaştırmalı çalışmalar, monositlerin T hücrelerine kıyasla daha fazla mitokondriyal membran potansiyeli kaybı gösterdiğini göstermiştir. ADP'nin mitokondriyal membran potansiyeli üzerindeki yarı maksimal inhibitör konsantrasyonu, monositler için T hücrelerine kıyasla daha düşüktü.
Her iki hücre tipinde de ADP ile oksijen tüketim oranlarında tipik bir doz yanıt artışı tespit edilmemiştir.
