% 10 FBS ile desteklenmiş DMEM ile altı oyuklu bir plakada oyuk başına 10 ila beşinci DF-1 hücresi kültüre başlamak için. Hücreler% 80 birleşmeye ulaştığında, serum içeren hücre kültürü ortamını atın. Hücreleri PBS ile üç kez yıkadıktan sonra, iki mililitre serum içermeyen hücre kültürü ortamı ve ardından her bir oyuğa IBDV virüs çözeltisi ekleyin.
Bir saatlik virüs emiliminden sonra, hücreleri PBS ile üç kez yıkayın ve% 2 FBS ile takviye edilmiş iki mililitre DMEM ile 24 saat boyunca inkübe edin. Kuyucuk başına 500 mikrolitre tripsin ekleyin, ardından bir dakika sonra% 10 FBS ile iki mililitre DMEM ekleyin. Hücreleri santrifüjleyin ve süpernatanı dikkatlice çıkarın.
Hücre peletini PBS'de yeniden süspanse ettikten sonra, tüpü üç saniye boyunca hafifçe girdaplayın ve hücreleri daha önce tarif edildiği gibi santrifüjleyin. Mikroskop altında bir hemositometre kullanarak, hücreleri uygun bir hacimde akış sitometrisi boyama tamponunda yeniden süspanse etmek için sayın ve süspansiyonu girdaplayın. Beş mililitrelik yuvarlak tabanlı polistiren tüpe 100 mikrolitre tek hücreli süspansiyon ekleyin.
IBDV ile enfekte olmuş hücreleri ve sahte kontrol hücrelerini karanlıkta 30 dakika boyunca buz üzerinde bir mikrogram uygun antikor ile inkübe edin. Her 10 dakikada bir hafifçe girdap tüpü. Hücreleri bir mililitre akış sitometrisi boyama tamponu ile yıkayın ve tüpü santrifüjleyin.
Süpernatanı attıktan sonra, peleti 100 mikrolitre akış sitometrisi boyama tamponunda yeniden süspanse edin. Daha sonra hücreleri karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika boyunca mililitre propidyum iyodür başına 10 mikrogram ile inkübe edin. Ve akış sitometrisi testi için 400 mikrolitre akış sitometrisi boyama tamponu ekleyin.
Tüm numuneleri çalıştırmadan önce voltaj ve kompanzasyon parametrelerini ayarlamak için boş kontrol tüpü ve ardından tek lekeli tüpler ile akış sitometrisi gerçekleştirin. Akış sitometrisi, IBV enfeksiyonundan sonra tavuk Gasdermin E'nin N-terminal fragmanları için önemli sayıda hücrenin pozitif olduğunu, buna karşın parçalanmış tavuk Gasdermin E'nin C-terminal fragmanlarının, membran yüzey antijen boyaması kullanılarak akış sitometrisi ile zar zor tespit edilebildiğini gösterdi. IBDV ile enfekte olmuş hücrelerde tavuk Gasdermin E ve propidium iyodür çift pozitif hücrelerin N-terminal fragmanlarının popülasyonu, sahte enfekte kontrollerinkinden önemli ölçüde daha fazlaydı, bu da IBDV ile enfekte olmuş hücrelerin bu kısmının piroptoz geçirdiğini düşündürdü.
