Başlamak için, deneysel dişi fareyi çalışan bir platforma yerleştirin. İntraperitoral olarak, ilk gün saat 20:00 civarında 7.5 uluslararası hamile kısrak serumu gonadotropin uygulayın. 48 saat sonra, intraperitoneal olarak 7.5 uluslararası insan koryonik gonadotropin birimi enjekte edin.
Bir hücre kültürü kabı kapağını üst ve alt yarıya bölün. Üst yarısına, sperm yerleştirme için her biri beş mikrolitrelik dört ila altı damla PVP yerleştirin. ICSI prosedürü için alt yarıya her biri beş mikrolitrelik 8 ila 10 damla M2 ortamı ekleyin.
PVP ve M2 orta damlacıklarını yaklaşık üç mililitre mineral yağ ile örtün. Ötenazi yapılmış erkek fareden epididimal kaudayı izole ettikten sonra, sterilize edilmiş gazlı bez üzerine nazikçe kurulayın. Kauda epididimini kesin ve spermi serbest bırakmak için forseps kullanarak hafifçe sıkın, bunları önceden dengelenmiş insan tüp sıvısı tüplerinde toplayın.
Kauda epididimini önceden ısıtılmış insan tubal sıvı ortamında durulayın. Tüpü 37 santigrat derecede ve sperm kapasitasyonu için% 5 karbondioksit inkübatörde açıkta yerleştirin. İnsan koryonik gonadotropin enjekte edildikten sonraki dördüncü günde, ötenazi yapılmış dişi fareyi diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin.
25 gauge bir iğne kullanarak, çok sayıda kümülüs oosit kompleksini serbest bırakmak için yumurta kanalının ampullasını yırtın. Kapasitasyondan sonra, kafaları kuyruklardan ayırmak için spermin 100 mikrolitresini beş saniye boyunca sonikleştirin. Mikromanipülasyon iğnesini çalışma sıvısı ile doldurun ve doldurulan kısmın iğnenin içinde 0,5 santimetre olduğundan emin olun.
İğneyi mikromanipülatörün sağ koluna takın ve tutma kapağını sıkarak sabitleyin. Ardından, mikromanipülatörün sol koluna düz uçlu bir mikromanipülasyon tutma pipeti takın. Enjeksiyon iğnesini ve tutma pipetini mikroskobun görüş alanına yerleştirin.
Bir polarizasyon mikroskobu altında, iğ aparatının enjeksiyon tarafında olmadığından emin olmak için metafaz milinin oosit içindeki konumunu belirleyin. Enjeksiyon iğnesinin zona pellucida ile teması üzerine, Piezo darbelerini beş yoğunlukta ve bir frekansta aktive edin, zona pellucida'da bir delik oluşturun ve enjeksiyon iğnesinin geçmesine izin verin. Piezo darbeleri bir yoğunlukta ve bir frekansta kullanarak, plazma zarında küçük bir gözenek oluşturun ve sperm başının ooplazmaya enjekte edilmesini sağlayın.
Atravmatik forseps kullanarak, anestezi uygulanmış yalancı hamile dişi fareden yumurtalıkları, yumurta kanallarını ve uterusu dikkatlice dışlayın. Kan damarlarından kaçınarak uterotubal bileşkenin altındaki uterus duvarında bir şırınga iğnesinin ucunu kullanarak yukarı doğru açılı küçük bir kesi yapın. Yumurta kanalını küçük delikten iki ila üç milimetre yavaşça sokun.
ICSI yöntemi kullanılarak, farelerde %89.57'lik bir döllenme oranı elde edildi ve zigotların %87.38'i ICSI'den sonraki 24 saat içinde 2 hücreli embriyo aşamasına ilerledi. Embriyo transferi sonrası canlı yavruların doğum oranı %42.5 olarak gözlendiDoğal olarak doğan fareler ile ICSI fareleri arasında rastgele kan şekeri seviyelerinde anlamlı bir dalgalanma yoktu. Bununla birlikte, erkek ICSI fareleri sürekli olarak yüksek açlık kan şekeri seviyeleri sergiledi ve bu da bozulmuş glikoz homeostazını düşündürdü.
Glukoz tolerans testlerinde, erkek ICSI ve kontrol fareleri arasında kan şekeri seviyelerinde önemli farklılıklar gözlenirken, dişi farelerde fark gözlenmedi. Vücut ağırlığı takibinde, hem erkek hem de dişi ICSI fareleri, kontrollere kıyasla aşırı kilolu bir fenotip sergiledi.
