Tek Hücreli RNA Dizilimi ve Metabolomikler için Rhesus Makak Pankreas Adacıklarının Hücresel Fraksiyonasyonu

Başlamak için, izole edilmiş rhesus makak pankreas adacık dokusunu buz üzerinde çözün. Doku peletine 500 mikrolitre 0.1X lizis tamponu ekleyin. Tek kullanımlık RNaz içermeyen bir pelet tokmağı kullanarak, dokuyu buz üzerinde 15 kez nazikçe homojenize edin.

Numuneyi buz üzerinde 10 dakika inkübe edin. Daha sonra homojenata 500 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin ve pipetle buz üzerinde hafifçe karıştırın. 30 mikrometrelik bir ön ayırma filtresini 300 mililitre yıkama tamponu ile doldurun ve bir mililitre hücresel homojenatı beş mililitrelik bir tüpe süzün.

Filtrelenmiş homojenatı 500 g'da dört santigrat derecede sallanan bir kova santrifüjünde beş dakika döndürün. Bir pipet kullanarak, süpernatantın bir mililitresini buz üzerindeki bir kriyoviyal içine aktarın ve gelecekteki metabolomik deneyler için hemen eksi 80 santigrat derecede dondurun. Yeniden süspanse etmek için çekirdek peletine damla damla bir mililitre yıkama tamponu ekleyin.

Yıkanmış peleti 1.000 g'da beş dakika boyunca dört santigrat derecede sallanan bir kova santrifüjünde döndürün. Yıkamayı tekrarladıktan sonra, çekirdekleri bir mililitre yıkama tamponunda yeniden süspanse edin. Bir pipetle, her biri 10 mikrolitre çekirdek süspansiyonu ve% 0.4 Tripan Mavisini ayrı bir tüpte karıştırın ve karışımı otomatik bir hücre sayacı slaydına ekleyin.

Son olarak, bir hücre sayacı kullanarak çekirdek konsantrasyonunu belirleyin. Dizileme deneyleri için ideal bir sağlam çekirdek elde edildi. Gen ekspresyonu çalışmalarına dayanarak, izole edilmiş fetal, insan olmayan, primat adacıkları içindeki hücresel alt tiplerin UMAP kümelemesi elde edildi.

Dihidroksiaseton fosfat, gliserol 3-fosfat, 2-oksoglutarat, kreatin ve glutatyon gibi adacık metaboliti bolluğu sitozolik fraksiyonlar kullanılarak elde edildi.