Başlamak için, 0.1 ila iki mililitrelik bir hacimde mililitre başına sekiz hücrenin gücüne bir kez 10 ile bir fare dalağı tek hücreli süspansiyon hazırlayın. Numuneye 50 mikrolitre sıçan serumu ekleyin. Numuneyi beş mililitrelik polistiren yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın.
Numuneye 50 mikrolitre izolasyon kokteyli ekleyin. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 7,5 dakika inkübe edin. Şimdi mililitre tükenme kokteyli başına 50 mikrolitre ekleyin.
İyice karıştırın ve 2,5 dakika inkübe edin. Bu arada, eşit dağılmayı sağlamak için manyetik boncukları girdaplayın. Numuneye 75 mikrolitre manyetik boncuk ekleyin.
İyice karıştırın ve 2,5 dakika inkübe edin. Numuneyi RPMI 1640 orta ile 2,5 mililitrelik son hacme kadar doldurun ve birkaç kez karıştırın. Ardından tüpü 2,5 dakika boyunca mıknatısın içine yerleştirin.
Mıknatısı alın ve zenginleştirilmiş hücre süspansiyonunu yeni bir tüpe dökerek tüp ile sürekli bir hareketle ters çevirin. Bir hemositometre kullanarak hücre numarasını belirleyin. İzolasyondan önce ve sonra naif CD dört pozitif T hücresi için akış sitometrik analizi yapın.
Geçitlemeden sonra, hücre süspansiyonunu yeni bir santrifüj tüpüne aktarın. Beş dakika boyunca 400G'de santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Pelet, %10 FBS ile desteklenmiş 200 ila 500 mikrolitre RPMI 1640 ortamında yeniden süspanse edin.
Her bir mililitre hücre kültürü için iki mikrolitre lökosit aktivasyon kokteyli ekleyin ve karıştırın. Hücreleri bir karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede doymuş nem ile dört ila altı saat boyunca kültürleyin.