Başlamak için, önceden ısıtılmış görüntüleme ortamını ve kaplanmış veya kaplamasız kapak camı yüzeyli steril mikroskopi kaplarını bir çalışma platformuna yerleştirin. Agaroz kalıbını çevreleyen ortamı çıkardıktan sonra, yüzen sferoidleri iki mililitrelik bir şişeye aktarmadan önce kalıpların içeriğini 190 mikrolitrelik ortamda dikkatlice yeniden süspanse edin. Düşük bağlantılı bir plakadaki sferoidler için, sferoidleri tek tek oyuklardan bir şişeye aktarın.
Sferoidlerin şişenin dibine beş dakika boyunca yerleşmesine ve görünür bir topak oluşturmasına izin verin. Ortamı şişeden çıkarın, sferoidleri rahatsız etmeden bırakın ve yeterli miktarda taze McCoy's 5A ortamında nazikçe yeniden süspanse edin. Şimdi, mikroskopi kabının oyuğu başına eşit hacimde sferoid süspansiyon aktarın.
Sferoidi bir karbondioksit inkübatörde 37 santigrat derecede 1 ila 2 saat inkübe edin. Bilinen bir küresel süspansiyon hacmine bir floresan probu ekleyin ve 37 santigrat derecede 1 saat inkübasyona devam edin. İnkübasyondan sonra, floresan probları içeren ortamı gerekli miktarda görüntüleme ortamı ile değiştirin.
Mikroskop kontrol yazılımını başlatın ve s'yi başlatıntage kalibrasyonu. Ardından, gerekli reklam verme amacını seçin. Projeyi aç penceresini seçin ve Yeni Proje Oluştur'a tıklayın.
Ardından, yeni oluşturulan projeye sağ tıklayın ve açılır menüden Yeniden Adlandır seçeneğini seçin. Araştırma projesi dosyasına standart bir ad verin. Edinme penceresini açın.
Darbeli beyaz ışık lazer uyarma dalga boyunu ve gerekli hibrit veya rezonans tarama dedektörleri aralığını ayarlayın. Ardından, tarama için çizgi veya çerçeve türlerini seçin. Alma penceresinde, foton sayma ile birlikte görüntüleme gerçekleştirmek için FLIM modunu seçin.
Ardından, beyaz ışık lazer darbesi tekrarlama oranını seçin. Hızlı Canlı modunu kullanarak önizleme görüntülemesini başlatın ve görüntüleme nesnesinin ince odağını ilgilenilen bir bölüme ayarlayın. Piksel yoğunluğu histogramına bakarak, uygun lazer yoğunluğunu, iğne deliği boyutunu ve çözünürlüğünü ayarlayın.
Fast Live'dayken, koordinatları ve tarama yönünü ayarlayın ve bunları Z-Stack penceresinde başlayacak ve bitecek şekilde ilişkilendirin. Bir z adım boyutu veya adım sayısı seçin. Gerekli tüm ayarlar uygulandıktan sonra görüntülemeye başlayın.
Görüntüye uygun bir ad verin ve görüntüleme projesini kaydedin. Farklı oluşum yöntemleri, değişen sferoid boyutlarına neden oldu. Düşük bağlantı plakalarındaki HCT116 sferoidleri, yüksek verimli yöntemlere kıyasla beş gün sonra önemli ölçüde daha büyüktü.
Düşük bağlanma yöntemleri, propidyum iyodür boyaması ile tespit edilen bir nekrotik çekirdeğin belirgin bir şekilde gelişmesine yol açtı. Buna karşılık, diğer yöntemlerle üretilen sferoidler, ölü hücrelerin sferoid cisim boyunca dağınık dağılımını gösterdi. Farklı yöntemlerle üretilen HCT116 sferoidlerindeki oksijenasyon, Sphericalplate 5D'ye göre mikrodoku ve laboratuvar yapımı mikro kalıplarla daha fazla oksijenli sferoid gösterdi.
Küresel plaka 5D sferoidlerin sferoid oksijenasyonu, mikrodoku ve laboratuvar yapımı mikro kalıplara kıyasla daha düşük oksijenasyon gösterdi. Düşük bağlantılı plakalar kullanılarak yapılan HCT116 sferoidlerinin fazör analizi, iki fotonlu NADPH-FLIM yoluyla glikolitik ve glikolitik olmayan çekirdeklerin varlığını ortaya koymaktadır.
