Lentiviral Transdüksiyon Yoluyla Hipoksiye Duyarlı CAR-T Hücrelerinin Geliştirilmesi

Başlamak için, 37 santigrat derecede bir su banyosuna dondurularak saklanmış insan periferik kan mononükleer hücrelerinden oluşan bir şişe yerleştirin. Çözüldükten sonra, PBMC süspansiyonunu dokuz mililitre TGM içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Saymak için hücre süspansiyonunun bir kısmını pipetledikten sonra tüpü beş dakika boyunca 300 G'de santrifüjleyin.

Peletlenmiş PBMC'yi üç mililitre TGM içinde yeniden süspanse edin. Ardından, gerekli hacimde hücre süspansiyonunu altı oyuklu bir plakaya aktarın. Hücre resüsitasyonundan bir gün önce, 100 mikrolitre fare immünoglobulin G manyetik boncuklarını 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.

Tüplere bir mililitre PBS ekleyin ve boncukları yıkamak için manyetik bir stand üzerine yerleştirin. Boncukları 100 mikrolitre PBS'de tekrar süspanse edin. Ardından antikorları süspansiyona ekleyin.

Süspansiyonu iyice karıştırmak için bir pipet kullanın. Süspansiyonu gece boyunca dört santigrat derecede bir külbütöre yerleştirin. Boncukları daha önce yapıldığı gibi PBS'de yıkadıktan sonra, 100 mikrolitre PBS'de tekrar süspanse edin.

Şimdi NHCD3 hCD28 kaplı immüno boncukları plakaya ekleyin ve inkübe edin. 48 saatlik inkübasyondan sonra, hücre süspansiyonunu karıştırın ve 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Tüpü üç dakika boyunca manyetik bir stand üzerine yerleştirin.

Ardından süpernatanı 15 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. 300 mikrolitre TGM'de beş PBMC'nin gücüne beş kez 10 kez tohumlayın, 48 kuyulu düz bir plakanın kuyucuklarına. 200 mikrolitre lentiviral stoğu ilgili kuyucuklara pipetleyin.

Daha sonra, santrifüjlemeden önce mililitre başına 10 mikrogramlık bir nihai konsantrasyona protamin sülfat ekleyin. Her oyuktan 300 mikrolitre süpernatan pipetleyin, ardından her oyuğa bir mililitre taze TGM ekleyin. Plakayı% 5 karbondioksit altında 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin.

Her iki ila üç günde bir plakaya taze 0,5 ila iki mililitre TGM ekleyin. Daha sonra hücreleri 12 oyuklu bir plakaya aktarın, ardından toplam hücre yoğunluğu dört mililitrelik bir hacimde 6 milyona ulaşana kadar altı oyuklu bir plakaya aktarın.