Başlamak için, 34 gauge künt bir iğneye bağlı steril 10 mikrolitrelik bir cam Hamilton şırıngasına beş mikrolitre hoechst solüsyonu yükleyin. Bu şırınga iğnesini, kendinden sızdırmaz kornea tünelinden ön kamaraya yerleştirin ve çözeltiyi enjekte edin. Tüm sıvı temizlenene kadar iğneyi iki ila üç saniye yerinde tutun.
Sızıntıyı önlemek için iğneyi çıkarmak için yavaşça dışarı çekin. Sonra, her iki gözü de enüklee edin. Korneaları izole etmek için, optik sinirin etrafındaki sklerayı kesin ve optik sinirden korneaya doğru dört ek kesi daha yapın.
Fazla sıvıyı Whatman filtre kağıdı ile boşaltın. Kesilen sklerayı yayın ve retinayı skleradan ayırın. Lensi ve retinayı dışarı çekin ve atın.
Sonra, irisi çıkarın. Kornea etrafındaki sklerayı kesin ve atın. Ve korneayı dikkatlice yukarı kaldırın.
Korneaları bir cam slayt üzerine yerleştirerek, endotel hücrelerini tanımlamak için% 0.5 Alizarin Kırmızısı ile boyayın. Fazla lekeyi çıkardıktan sonra korneayı üç kez yıkayın ve üzerine bir örtü astarı yerleştirin. Endotel hücrelerinin Alizarin Kırmızısı boyamasını görüntülemek için korneaları ışık mikroskobu altında inceleyin.
Ayrıca, hoechst lekelenmesini gözlemlemek için korneaları floresan mikroskobu altında değerlendirin ve kontrol olarak enjekte edilmeyen kornea ile karşılaştırın. DNA bağlayıcı hücre geçirgen bir floresan markör olan Hoechst boyası, intrakameral enjeksiyon yoluyla ilaç biyoyararlanımını değerlendirmek için kullanıldı. Hoechst'in kornea endotel hücre tutulumu, enjeksiyondan 15 dakika sonra floresan mikroskobu ile incelendi.
Alizarin Kırmızı boyama, endotel tabakasının hücreler arası sınırlarını vurguladı. Ayrıca, kornea endotel hücre çekirdekleri içindeki pozitif hoechst boyama, boyanın bu yöntemle başarılı bir şekilde verildiğini doğruladı.