İzole Gastrülan Murin Embriyolarının Aynı Gün Genotiplemesi

Viseral yumurta sarısı kesesini fare embriyosundan izole ettikten sonra, her bir yumurta sarısı kesesini sekiz şeritli bir polimeraz zincir reaksiyonu veya PCR tüpünde sindirmeye devam edin. Bir P20 pipeti kullanarak, her bir yumurta sarısı kesesi örneğine 19.3 mikrolitre PCR şablonu DNA lizis tamponu ve mililitre proteinaz K başına 0.7 mikrolitre 0.2 mikrogram ekleyin. Numuneyi 10 saniye boyunca vorteksleyin.

Ve şerit adaptörlü bir mini santrifüj kullanarak, numuneleri 1000 G'de 10 saniye boyunca döndürün. Sekiz şeritli PCR tüpünü 45 dakika boyunca 85 derecelik bir ısı bloğuna yerleştirin ve her beş dakikada bir beş saniye girdap yapın. 45 dakika sonra, istenen genetik tanımlama için PCR ile devam etmeden önce tüp şeridini 1000 G'de 10 saniye boyunca tekrar döndürün.

Cre genotiplemesi için PCR reaksiyonunu gerçekleştirmek için, her bir yumurta sarısı kesesi için sekiz şerit PCR tüpü başına görüntülenen bileşenleri içeren bir PCR ana karışımı hazırlayın. Görüntülenen döngüyü kullanarak PCR termal döngü amplifikasyon programı. Ardından, genotipleme sonuçları çıkarmak için PCR ürünlerini %1'lik bir agaroz jel üzerinde çalıştırın.

Kalan sindirilmiş yumurta sarısı kesesi örneklerini uzun süreli saklama için eksi 20 derecelik bir dondurucuda saklayın. PCR ürünü bir agaroz jel üzerinde ayrıldığında, LoxP ve vahşi tip alellerin yanı sıra Cre aleli için beklenen parça boyutları görüldü.